目的 电压门控性钠通道蛋白的基因变异与钠离子通道功能异常都和癫痫的遗传性具有密切关系,本实验以遗传性震颤鼠为实验对象,采用抑制性消减杂交为主要技术手段,寻找震颤鼠电压门控性钠通道基因变异相关的差异表达基因。为筛选新的癫痫特异表达基因和基因治疗奠定基础。 方法 遗传性震颤大鼠及正常大鼠各10只(震颤鼠为Tester,正常大鼠为Driver),快速断头取脑后分离海马组织,提取总RNA。然后,进行甲醛变性电泳检测总RNA的质量。总RNA分离纯化为mRNA,用PCR-Select cD-NA subtraction试剂盒在反转录酶的作用制备震颤鼠及正常大鼠的双链cD-NA。Tester和Driver的cDNA分别用同一种识别四碱基序列的限制性内切酶Rsa Ⅰ消化形成平均长度大于500bp的cDNA片段。将Tester cDNA均分为两份,分别接上接头Adaptor 1和Adaptor 2R.接头外侧序列与第1次PCR引物序列相同,而内侧序列则与第2次PCR(巢式PCR)引物序列相同,有利于后续PCR的筛选扩增。此外接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点,为以后克隆和测序提供方便。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定连接效率在25%以上,说明cDNA片段接头连接效率较高。两轮消减杂交:用过量Driver cDNA样品分别与上述两份连有接头的Tester cDNA样品进行第1次消减杂交。然后,混合上述两份杂交样品,同时加入新的变性Driver cD-NA进行第2次消减杂交,这一次杂交进一步富集了差异表达的cDNA。两次PCR反应:加入根据接头设计的引物进行两次PCR。第一次PCR基于抑制反应,只有两端连接有2个不同接头的双链cDNA片段才能得到指数扩增。第二次PCR实际上是巢式PCR,极大地提高了扩增特异性,使差异表