【摘 要】
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类脂A(Lipid A),也被称为内毒素,是革兰氏阴性菌外膜组成结构脂多糖的主要组成部分。Lipid A对细菌的致病能力以及细菌对抗外界环境都非常重要。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是存在于海鲜等水产品中的条件致病菌,经常引起大规模中毒事件。作为致病菌,Vibrio parahaemolyticus中Lipid A的结构及生物合成尚未有研究。本论文研究了V.parah
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类脂A(Lipid A),也被称为内毒素,是革兰氏阴性菌外膜组成结构脂多糖的主要组成部分。Lipid A对细菌的致病能力以及细菌对抗外界环境都非常重要。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是存在于海鲜等水产品中的条件致病菌,经常引起大规模中毒事件。作为致病菌,Vibrio parahaemolyticus中Lipid A的结构及生物合成尚未有研究。本论文研究了V.parahaemolyticus ATCC33846中与Lipid A生物合成相关的基因。鉴定了相关基因的功能,并研究了Lipid A结构改变对V.parahaemolyticus生长状况、耐药性、渗透性等影响。主要结论如下:(1)通过基因比对,发现V.parahaemolyticus ATCC33846中有四个可能与Lipid A合成过程中二次酰化相关的基因:VP_RS01045、VP_RS00880、VP_RS08405和VP_RS12170。(2)大肠杆菌(Escherichia coli)MLK1067产生五酰化的Lipid A,在C3’位置缺少次级脂肪酸链。当这四个基因在MLK1067过表达时,仅在过表达VP_RS01045菌株中观察到Lipid A的C3’位置添加了C12:0次级脂肪酸链。结果说明VP_RS01045编码的酶可催化添加一条C12:0在Lipid A的C3’位置。(3)E.coli MKV15b产生四酰化的Lipid A,在C2’和C3’位置缺少次级脂肪酸链。当这四个基因MKV15b中过表达时,过表达VP_RS01045菌株中再次观察到Lipid A的C3’位置添加了C12:0次级脂肪酸链。在分别过表达VP_RS00880、VP_RS08405和VP_RS12170基因的菌株中,都观察到Lipid A C2’位置添加了一条C14:0次级脂肪酸链。结果说明VP_RS00880、VP_RS08405和VP_RS12170编码的酶,也是Lipid A的次级脂肪酸链转移酶。(4)在V.parahaemolyticus ATCC33846分别敲除VP_RS01045、VP_RS00880、VP_RS08405和VP_RS12170后,得到了突变菌株VPW001、VPW002、VPW003和VPW004。通过对其Lipid A结构与基因转录水平的分析,发现这四个基因在V.parahaemolyticus中可能存在着功能互补。单个基因的缺失,对Lipid A结构影响并不大。(5)对V.parahaemolyticus ATCC33846、VPW001、VPW002、VPW003和VPW004这五个菌株,进行了不同环境下的生长情况对比,发现VP_RS08405基因的缺失,细菌在37℃下生长变缓慢;VP_RS01045、VP_RS08405的缺失后,细菌可在p H为5.0的环境下生长。VP_RS01045缺失后,多粘菌素B的MIC值由野生型的50μg·m L-1减小为25μg·m L-1;多粘菌素E的MIC值由野生型的100μg·m L-1减小为50μg·m L-1。本论文的研究成果为我们进一步研究V.parahaemolyticus中Lipid A的结构和生物合成提供基础。
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