“四时五脏阴阳”理论,是从时间结构的角度认识人体生命,以解释人体各种生理、病理变化规律所形成的本质和基础,通过对不同时相中人体生理机能变化表现于外的状态进行观察和分析,来认识和探讨内在脏腑的实质。1目的采用实验方法,以“褪黑素”为切入点,考察“四时五脏阴阳”理论的生物学基础,掌握四季对机体影响的规律。同时利用四季模拟系统,探讨运用人工模拟的方法来研究气候变化对机体的生理病理影响机制的科学性和可知性,为人工模拟季节的可行性和可信性提供相关数据,以期为“四时五脏阴阳”理论的研究提供新的途经。2方法2.1研究概述以仓鼠为研究对象,以褪黑素为切入口,以白天/黑夜时间变化为依据,选取春分夏至、秋分和冬至的时间点,以褪黑素合成限速酶HIOMT为指标,观察生理状态下,松果腺、下丘脑、垂体中褪黑素合成限速酶HIOMT活性、蛋白质水平及松果腺中mRNA表达的季节变化规律,并分析其相关性。同时利用四季模拟系统,比较上述指标人工模拟四季与自然四季的变化情况。2.2实验对象雄性仓鼠(金黄地鼠),二月龄,在春分日、秋分日、冬至日、夏至日前1m购入,按随机数字表法,随机分为自然气候、人工模拟气候两个大组,分别有春分、夏至、秋分、冬至四个节气组,每组各8只。即每个大组共32只。不同组动物分笼饲养,人工模拟组放在人工模拟系统箱中饲养,其余条件相同,给予充足的水和食。饲料为普通鼠全价颗粒饲料,由北京维通利华动物研究中心提供。自然气候组：仓鼠饲养于采光充足室温可控的动物房,自然光照(不加人工照明)；室温：春季和秋季(20±2)叁,冬季(17±2)℃,夏季(25±2)℃。湿度自然。人工模拟气候组：采用四季模拟系统箱,饲养动物,进行反季模拟。四季模拟箱中的模拟季节与时令季节相反(冬季时模拟夏季；夏季时模拟冬季；秋季模拟春季；春季模拟秋季)。人工模拟季节的主要控制参数为光照、温度、湿度,并且以昼夜长短变化为最主要参数。春分日(3月21日)秋分日(9月22日)冬至日(12月22日)和夏至日(6月21日)晚9时进行取材实验。2.3指标测定松果腺、下丘脑、垂体中褪黑素合成限速酶HIOMT蛋白质水平和酶活性测定,酶联免疫法；松果腺中褪黑素合成限速酶HIOMT mRNA表达量测定,荧光实时定量PCR(Real-time)PCR法。2.4统计学方法数据以均数±标准差(x±S)表示。运用SPSS19.0软件,采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计处理,以P<0.05作为差异有统计学意义的界限。3结果3.1在自然气候条件下,松果腺中褪黑素合成限速酶HIOMT总蛋白含量在冬季最高,春季最低。冬与春相比,有显著性差异(p<0.05)；垂体中褪黑素合成限速酶HIOMT总蛋白含量亦为冬季最高,其他三组接近,冬季组与其他三组相比,各组间相比,有显著性差异(p<0.05)；下丘脑中褪黑素合成限速酶HIOMT总蛋白含量在秋季最高,与其他三组相比,有显著性差异(p<0.05)；其他组别之间相比,季节性差异不明显(p>0.05)。松果腺、垂体、下丘脑中褪黑素合成限速酶HIOMT酶活性季节性变化不明显,除垂体中HIOMT酶活性春、秋组之间有明显差异外(p<0.05),其他各组间相比,均无显著性差异(p>0.05)。说明HIOMT酶活性可随季节变化发生一定的波动,但其差异无统计学意义。3.2在自然气候条件下,松果腺中HIOMT酶的mRNA表达的季节性变化规律,为冬季最高,夏季最低。其中冬季组松果腺中HIOMT酶的mRNA表达与其他三个季节相比,夏季组与秋季组相比,均有显著性差异(p<0.05)。3.3人工模拟条件下,松果腺中褪黑素合成限速酶HIOMT mRNA的表达与自然条件下节律一致,相应的组别之间无显著性差异(p>0.05),提示模拟较为成功。4结论季节气候的变化可以使机体相应的整体功能发生改变,而且其内在规律存在与中医五脏功能相吻合的归类性。这为从时间结构角度,以脏应时的研究思路提供了可行性依据人工模拟条件下,气候对机体的影响与自然季节基本一致。提示应用人工模拟系统模拟自然季节较为成功,利用其模拟季节进行科学研究的思路具有可行性。松果腺-褪黑素在气候因素对机体生理病理影响中具有重要作用。同时在研究过程中,一些实验结果如人工模拟条件下,褪黑素合成限速酶HIOMT的蛋白含量等指标等也表现出了与主体结果的不一致性,这一方面表明了机体功能、气候因素的复杂性,同时也反映出该研究继续的必要性。