细胞因子是由免疫细胞（如单核—吞噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（如血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等）经刺激而合成，分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，作为细胞间信号传递分子，主要调节免疫应答，参与免疫细胞分化发育，介导炎症反应，刺激造血功能并参与组织修复等，按其主要功能可分为白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、生长因子（growth factor，GF）和趋化性细胞因子（chemokines）六大类。细胞因子融合蛋白（cytokine fusion protein）是当今免疫学研究的一个热点问题，利用基因工程方法将两种或多种细胞因子融合在一起，是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性，而各自作用靶点不同，其融合基因表达产物既具有其组成因子独特的生物学活性，还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子更佳的生物学活性。迄今为止，国内外学者都已经在该方面开展了深入的研究，构建了多种融合蛋白，其中一些细胞因子融合蛋白如胰岛素样生长因子—Ⅱ和白介素—3（IGF-Ⅱ／IL-3）的融合蛋白因表现出良好的生物学功能而显现出诱人的临床应用前景。CXCL14是第二军医大学免疫研究所从人DC的cDNA文库中克隆得到的一个新的CXC类趋化因子，与趋化因子MIP-2α、MIP-2β高度同源，但不含ELR基序（Glu-Leu-Arg），故将其命名为γ型巨噬细胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein-2 gamma MIP-2γ），现国际统一命名为CXCL14。以往的研究工作初步证明该新型趋化因子不仅对中性粒细胞、未成熟树突状细胞、造血干／祖细胞等造血与免疫细胞具有定向趋化作用，而且还具有一定的造血调控活性，体外集落形成试验表明，该新型趋化因子可与多种造血生长因子协同，促进骨髓系及巨核系前体细胞的增殖及分化。GM-CSF是目前已知的一种具有广泛生物学活性的造血生长因子，主要由活化T细胞、活化巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞产生，可以刺激造血祖细胞和急、慢性髓样白血病细胞增殖；促进粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞增殖分化，增强它们杀菌、抗寄生虫及抗肿瘤作用；增强粒细胞吞噬活性并上调其黏附分子表达；促进单核细胞释放细胞因子；趋化粒细胞及单核细胞。最近研究表明：GM-CSF不仅是维持树突状细胞（dendritic cell，DC）活性，促进DC在体外分化、发育必需的细胞因子，而且在增强DC抗原递呈功能和刺激T细胞增殖能力方面起关键性作用，临床上可用于感染性疾病及恶性肿瘤的免疫治疗。可见CXCL14与GM-CSF的生物学功能具有一定的互补性，若将两者结合到一起制成具有各自生物学活性的融合蛋白，则该蛋白可能发挥先将免疫细胞和造血细胞“趋化和聚集”，然后再“激活和增强”这些免疫造血细胞的功能。推测该融合蛋白可能会具有比单一细胞因子更好的生物学功能，有望成为一种在造血调控及抗肿瘤免疫中具有更佳生物学活性的新型细胞因子。另外，CXCL14作为一种新型趋化因子，其结构特点、受体、作用机制、信号传导途径还有诸多未解之处，构建制备hCXCL14／hGM-CSF融合蛋白并研究其相关功能和机理，也有助于我们深入揭示CXCL14的生物学功能及其作用机制。目的●构建hCXCL14／hGM-CSF融合基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K—hCXCL14／hGM-CSF，并在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115菌株中表达，筛选出hCXCL14／hGM-CSF融合基因多拷贝串联整合的稳定转化菌株，然后优化表达条件，最后经过发酵和甲醇诱导表达，获得具有hCXCL14和hGM-CSF双重活性的融合蛋白，并纯化该融合蛋白。方法1．利用分子生物工程技术，用EcoRⅠ和NotⅠ限制性核酸内切酶从重组pcDNA3.1（+）—hCXCL14／hGM-CSF质粒上双酶切下hCXCL14／hGM-CSF融合基因的cDNA片段并插到酵母穿梭载体pPIC9K上，经序列测定正确后，阳性重组质粒pPIC9K—hCXCL14／hGM-CSF经SalI酶线性化后，电转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，经表型筛选和G418抗性筛选后，对hCXCL14／hGM-CSF融合基因高拷贝串联整合的酵母表达菌株进行PCR鉴定。2．将酵母菌株按不同的条件进行培养，用R&D公司的人GM-CSF定量ELISA检测试剂盒检测OD₄₅₀值，快速定量检测工程菌表达上清中的GM-CSF浓度，据此来判定相应融合蛋白的含量，并采用分光光度计测定酵母菌培养液光密度OD₆₀₀值，两方面结合确定最佳表达条件。优化表达的条件包括培养基（BMMY，BMGY，BMM，YPD和MM），溶解氧浓度（50％，60％，70％，80％，90％），培养时间（24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，），甲醇诱导浓度（0.05％，0.075％，0.1％，0.15％，0.3％）。SDS-PAGE和Western blot分析鉴定融合蛋白的表达。3．发酵上清液经50％饱和硫酸铵盐析，50mM PBS（PH7.4）透析，经Hiprep16／10 Souce30Q柱阴离子层析和Sephasdex G200柱分子筛层析后得到纯化hCXCL14／hGM-CSF融合蛋白，并利用HPLC系统对其纯度进行分析。结果1．成功得到了酵母重组质粒pPIC9K—hCXCL14／hGM-CSF，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞后，经表型筛选和G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到hCXCL14／hGM-CSF融合基因高拷贝串联整合的His⁺Mut⁺重组酵母菌株。2．重组酵母菌株经过发酵和甲醇诱导后，表达出相对分子质量约为50kD左右，具有抗hCXCL14和抗hGM-CSF双抗原性的融合蛋白。3．将酵母菌株GS115／pPIC9K—hCXCL14／hGM-CSF的表达条件进行了优化，结果显示：表达该酵母工程菌的最佳培养基为BMMY培养基，溶解氧和甲醇诱导浓度分别为80％～90％和0.1％，最适诱导表达时间为72h。酵母发酵上清液经50％的饱和硫酸铵盐析，50mM PBS（PH7.4）透析，Hiprep16／10 Souce30Q柱阴离子层析和Sephasdex G200柱分子筛层析后，HPLC系统分析hCXCL14／hGM-CSF融合蛋白的纯度达95％左右。结论得到了重组酵母表达质粒pPIC9K—hCXCL14／hGM-CSF，获得了高效稳定表达hCXCL14／hGM-CSF融合蛋白的重组毕赤酵母菌株，对其表达条件进行了优化，确定了其表达的最佳培养基，溶解氧和甲醇诱导最佳浓度和最适诱导表达时间，并探索了hCXCL14／hGM-CSF融合蛋白的纯化条件，对融合蛋白hCXCL14／hGM-CSF进行了有效的纯化，这将有助于对其功能和作用机制的进一步研究。