一、研究背景和目的孤独症谱系障碍(ASD)是一类以交互性社交交流和社交互动的持续损害以及受限的、重复的行为、兴趣或活动模式为基本特征的神经发育障碍性疾病。这些症状从儿童早期出现,限制或损害了日常功能,且在不同患者之间具有极大的临床和病因异质性。自1943年首次被报道以来,ASD患病率呈明显上升趋势,目前已经接近人群的1%,男性多于女性。孤独症谱系障碍的病因和发病机制目前并不明了,多数学者认为是遗传和环境因素交互作用的结果,但遗传因素起到更重要的作用,双生子研究显示ASD的遗传度高达90%。随着研究的不断深入,目前较多研究者认为多种罕见的、具有高度外显率的遗传变异导致了 ASD的发生,拷贝数变异(CNVs)就是这类遗传变异的一种重要形式。孤独症谱系障碍是较早发现拷贝数变异的疾病之一。截止2018年9月,AutDB数据库已经收集了与孤独症相关的拷贝数变异2274个,且还有增加的趋势。但是这些拷贝数变异异质性较高,大部分没有被重复验证,特别是在我国ASD病例中进行验证。因此,本研究将利用高分辨率单核苷酸多态性微阵列技术对100例山东省ASD儿童进行全基因组拷贝数变异检测,对可疑致病性CNV利用实时荧光定量PCR技术进行验证,并进一步利用生物信息学方法筛选出相关致病基因分析其在ASD发病中的贡献,我们的研究结果将为孤独症病因学研究提供新的数据。二、研究对象和方法本研究招募100例在山东大学齐鲁儿童医院就诊和治疗的ASD儿童及其核心家系,其中男童84例,女童16例,男女比例为5.25:1;平均年龄4.36±2.42岁。所有入组儿童符合美国《精神障碍诊断与统计手册》第四版修订版(DSM-Ⅳ-TR)孤独症诊断标准,由山东大学齐鲁儿童医院两名副高职称以上专业医师确诊。排除慢性癫痫、脑炎、脑膜炎、严重的脑外伤等神经系统器质性疾病以及严重的或慢性的躯体疾病,经过血液遗传代谢性疾病检查和尿有机酸检查排除氨基酸、有机酸异常儿童,经过染色体核型检查排除染色体核型异常的儿童。首先提取ASD儿童基因组DNA,其次按照芯片标准实验流程进行DNA消化、连接、扩增、纯化、片段化、标记、杂交,以Fluidics Station 450洗涤工作站进行洗涤,GeneChip Scanner3000 7G 扫描仪扫描,Genotyping Console 分析软件对扫描结果数据进行分析,对得到的CNVs数据与在线公开数据库进行比对,鉴定出可疑致病性CNVs。利用实时荧光定量PCR技术对可疑致病CNVs区域进行验证分析,确定CNVs是新发变异还是父母传递下来的变异,同时排除芯片的假阳性结果。进一步利用生物信息学分析方法对这些拷贝数变异区域内的基因进行筛选,评价该基因与孤独症发病的相关性以及对发病风险的贡献。三、研究结果在100例ASD儿童中发现10个可疑致病性拷贝数变异,发生率为10%,包括7个缺失型CNVs和3个重复型CNVs。其中5个为新发变异,5个为父母传递下来的变异(2个遗传自父亲,3个遗传自母亲)。经进一步生物信息学分析,在这10个可疑致病性CNVs中筛选出1 1个可疑致病基因,分别为IMMP2L、AUTS2、GRM7、GBE1、NEO1、BBS4、ADPGK、HCN4、LRRC4C、CTNNA2 和IGBP1。1.IMMP2L基因缺失有3个病例的缺失片段位于7q31.1,干扰IMMP2L基因。第一个病例在chr7:111105975-111288089之间有大小为182kb的缺失;第二个病例在chr7:110963723-1 11209092之间有大小为245kb缺失;第三个病例在chr7:111077519-111278265之间有大小为201kb缺失。这些缺失破坏了位于染色体7q31.1的IMMP2L基因第1-3外显子的类似外显子区域,这些外显子区域通过实时定量PCR得到了验证。通过对来自在线公开数据库和合作实验室数据库中5568例ASD病例和10279例对照进行统计分析显示IMMP2L基因缺失在ASD组和对照组之间并没有统计学差异,提示IMMP2L基因与ASD之间无显著相关性。2.GRM7基因和AUTS2基因缺失分别在两个4岁ASD儿童样本中检测到两个新发缺失,其中1例位于7q1 1.22从chr7:68254845到chr7:69084409,大小为830Kb。该缺失位于AUTS2基因的上游远端,影响了AUTS2基因的转录和翻译启动子。另1例新发缺失位于3p26.1的chr3:7221090到chr3:7524552,大小为303Kb。该缺失破坏了 GRM7基因的五个编码外显子(外显子3至7),在侧翼内含子2和7中有断点。GRM7基因、AUTS2基因缺失与ASD的相关性在国外ASD病例均有报道,我们的数据进一步支持GRM7基因和AUTS2基因在神经发育障碍尤其是ASD中的致病作用。3.GBE1基因缺失携带有GBE1基因全部缺失的男童为重度ASD病例,表现为典型的社交障碍、刻板行为并伴有语言发育迟缓,随访发现康复效果较差。该缺失位于3p12.2从chr3:80780361到chr3:83213281,大小为2433Kb,为杂合缺失。GBE1基因是糖原累积病IⅣ型的致病基因,为隐性遗传。目前尚没有其与ASD相关的报道,但是有报道其在不同的癌症患者中表达水平不同,一项关于GBE1和神经胶质瘤的研究曾报道GBE1与β-catenin蛋白具有同步表达,而Wnt/β-catenin信号通路是目前认为与ASD发病有关的通路之一。结合患者临床表型,我们提出GBE1基因可能是ASD的候选致病基因,通过影响Wnt/β-catenin信号通路中的关键转录因子β-catenin从而对ASD的发病起到了一定的作用。这个发现为ASD病因学研究提供了新的思路。4.15q24 缺失本研究在1例2岁半ASD男童样本中检测到位于15q24.1q24.2的缺失,大小为2581Kb,在chr15:72964144-75544822之间。该区域致病基因包括BBS4、DPGK、NEO1、HCN4基因,结合文献报道和基因功能分析,考虑NEO1基因为导致本例患儿临床表型的关键基因。5.LRRC4C、CTNNA2 和IGBP1 基因微重复我们发现的3个重复片段均遗传自亲代,其中1个位于X染色体的Xq13.1,在chrX:69368049-69768574之间,大小为401Kb,遗传自母亲。另外两个均遗传自父亲,一个是位于11号染色体11p12 chr1140746589-40954326大小为208Kb的微重复,一个是在2p12chr2:78657154-79854651大小为1197Kb的较大片段的重复。Xq13.1重复序列包含IGBP1基因的5-7号外显子以及部分4号内含子,11p12重复序列包含LRRC4C基因的2号内含子,2p12重复序列包含CTNNA2基因的1号外显子和部分1号内含子。目前关于这三个基因和ASD相关的报道较少,且这三个ASD儿童的亲代均为健康人群且不具有ASD广泛表型,因此这三个基因是否与ASD相关尚需要更多ASD病例的进一步验证。四、研究结论1.山东省某三甲医院ASD儿童可疑致病性拷贝数变异发生率为10%。2.IMMP2L基因缺失与ASD之间无显著相关性。3.GRM7、AUTS2、NEO1基因变异在ASD发生中可能具有致病作用。4.GBE1基因为ASD的新候选致病基因,可能通过影响Wnt经典信号通路中的关键转录因子β-catenin从而对ASD的发病起到了一定的作用。