论文部分内容阅读
二十二碳六烯酸(DHA)是维持人体正常生长发育的重要成分。DHA作为人体必需不饱和脂肪酸,不能在人体内直接合成,只能从饮食中摄取。随着微藻源DHA在食品添加中的普遍应用,微藻源DHA的质量安全也逐渐受到消费者的关注。虽然有关DHA的研究报道和商业产品层出不穷,但目前市场上尚未生产出检测微藻源DHA含量的金标快速检测产品。为此,本课题在参考前人研究半抗原偶联技术、抗体制备技术等基础上,研究制备微藻源DHA偶联抗原和抗体。并对DHA抗原抗体在胶体金免疫层析技术上的应用进行初步探讨。本实验通过碳化二亚胺活性酯法和混合酸酐法,合成免疫抗原DHA-BSA和包被抗原DHA-OVA。通过蛋白电泳、红外光谱扫描、紫外光谱扫描分析,半抗原DHA与载体蛋白BSA、OVA偶联成功,且免疫抗原的偶联比为4:1和17:1,在适宜的偶联比范围内。用免疫抗原对Balb/c小鼠进行四次免疫,并取血清进行效价检测。最终选用20μg/ml的包被抗原进行包被,5%脱脂奶粉进行封闭,测得多抗血清效价为128000。通过阻断ELISA测定,DHA抗体的敏感性IC50为40.44μg/ml。用蛋白纯化柱Protein G对抗体进行纯化,纯化前浓度为3.427mg/ml,纯化后浓度为0.917mg/ml。经SDS-PAGE蛋白鉴定,抗体纯化效果较好,经还原性处理液处理后,显示重链和轻链两条条带。本实验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,通过调节柠檬酸三钠的添加量,确定胶体金烧制的最佳状态。当柠檬酸三钠与氯金酸添加量之比为1.5:1时,所制备的胶体金溶液色泽清透且稳定性较好,经可见光全波长扫描测得其最大吸收波长为521nm,粒径大小约为20nm,适合金标抗体的制备。在胶体金标记抗体过程中,通过调节K2C03的添加量来间接调节金标抗体制备的酸碱环境,调节抗体添加量使金标抗体稳定存在且具有活性。通过目测观察和可见光光度分析,确定K2CO3的最适添加量为4μl,抗体最适添加量为13μg。将处理后的金标抗体以6μl/cm包被在金标垫上,将50mg/ml包被抗原和0.2mg/ml羊抗鼠IgG分别以1μl/cm包被于NC膜上T、C线位置,组装完整胶体金免疫层析试纸条,用0.02M PBS溶液进行阴性测试,用DHA标准品进行阳性测试,完成微藻源DHA金标检测卡的初步探究。