喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤,占全身恶性肿瘤的1-5%,虽在全身恶性肿瘤中占据的位置不高,但在呼吸道及头颈部恶性肿瘤中的位置较为重要,在呼吸道恶性肿瘤中仅次于肺癌,占第二位,在头颈肿瘤中占第2-5位。喉癌多发生于40岁以上年龄人群,其中世界男女发病率之比大约为10:1,部分地区男女发病率差异略小,如我国东北地区男女发病率差异则小于世界水平。目前流行病学调查显示,吸烟和饮酒是喉癌发病的高危因素,但具体发病过程是个复杂的生物学变化,同所有的肿瘤一样,喉癌的发病和癌基因活化、抑癌基因失活有关,同时很多其它因素也可促进喉癌的发生和发展,如炎症状态、机体内离子通道功能改变等。喉癌的临床症状多表现为声音嘶哑、呼吸困难甚至吞咽困难等,若合并颈部淋巴结转移则表现为颈部包块。喉癌的病理类型大多数为鳞状细胞癌。目前喉癌的治疗提倡以手术治疗为主,结合放化疗的综合治疗方法,虽然喉癌的治疗经历了百余年的进展,喉癌发病及治疗的基础研究也在不停的进步,但喉癌患者的五年生存率及术后生存质量并未得到大幅改善。瞬时受体电位通道超家族(transient receptor potential,TRP)是一种非选择性钙离子通道,在钙离子信号转导通路中起重要作用。TRP通道目前一般分为两大类,第一类包括TRPA、TRPC、TRPN、TRPV,第二类包括TRPP和TRPML,他们均具有类似的结构,结构中均有一内嵌的发卡通道结构,TRP通道分布广泛,主要通过介导的钙离子内流作用参与调节机体的机械感觉、痛觉、味觉、肌肉收缩、细胞增生、分化、凋亡等众多生理病理反应。但各种TRP通道的作用并不完全相同,部分TRP通道亚类可以相互或协同作用调节生命活动。TRPP2通道作为TRP超家族中的一员,又称之为PKD2(polycystin-2),目前研究较多和确实的证据认为TRPP2的突变与多囊肾的发病密切相关。TRPP2在多种组织中广泛表达,如血管内皮平滑肌细胞、上皮细胞、心肌细胞、肾上腺和卵巢细胞。目前研究认为TRPP2的亚细胞定位有一定的争议,认为可表达于细胞质膜、高尔基体、内质网和原纤毛中,其中内质网的定位最为认同。在内质网中,TRPP2作为细胞内钙离子释放的通道,联合三磷酸肌醇受体和雷尼丁受体调节胞内钙离子的平衡,参与钙库介导的钙离子内流过程((store-operated calcium entry channels,SOCE),从而发挥各种生理和病理功能,如参与细胞增殖、凋亡、自吞噬等过程。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorɑ,TNF-ɑ)最初是以抗肿瘤因子被发现,是目前发现的最强的抗肿瘤因子,肿瘤坏死因α是一种多向性细胞因子,其在炎症反应、细胞分化、免疫调节以及抗感染、抗肿瘤方面有重要作用,但研究也表明肿瘤坏死因子α对肿瘤的作用因条件的不同可产生不同的结果,虽然是最强的抗肿瘤因子,但在某些情况下也可表现为促进肿瘤发生发展。生物信息学是近年来广泛应用于临床与基础研究的一门交叉学科,它结合了信息学、计算机学、统计学等多种技术对大量的生物数据从分子水平通过序列对比、通路分析、生物聚类、统计分析等进行分析、筛选,发现疾病的异常信息,可作为进一步证实研究的筛选手段,避免盲目无效性的研究。本研究应用人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系,通过表达谱测序、生物信息学技术、蛋白印迹、流式细胞术、细胞增殖实验、钙成像以及si RNA技术分两部分阐述了肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的m RNA表达谱的影响以及肿瘤坏死因子α通过抑制TRPP2的表达及其介导的内质网上钙离子释放来增强人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系的增殖。为进一步阐明TRPP2和肿瘤坏死因子α在人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖中的作用以及相关机制提供新的依据,有助于阐明喉癌的发生发展过程,并有利于对喉癌开发新的潜在治疗方向,为治疗喉癌提供实验室证据。1.肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞m RNA表达谱的影响及分析既往研究发现肿瘤坏死因子α对肿瘤的作用是双方面的,因为条件的不同可表现为促进或抑制。为探讨肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的作用,本研究利用m RNA测序技术、生物信息学分析技术,揭示了TRPP2相关m RNA在肿瘤坏死因子α处理的人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞PKD2基因的m RNA表达水平显著下降(和对照组相比),由此推测分析肿瘤坏死因子α可能是通过下调TRPP2导致人喉鳞状细胞癌细胞增殖的改变。但结论需要进一步的实验研究。2.肿瘤坏死因子α通过抑制TRPP2的表达促进人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2增殖的实验研究肿瘤坏死因子α和TRPP2都参与机体细胞的多种功能,研究表明,钙离子通道在肿瘤的发生发展中起重要作用,TRPP2作为钙离子通道中的一员,我们推测其在喉癌的增殖和发展中发挥着重要作用,通过第一部分的研究我们对经过肿瘤坏死因子α处理的人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2较对照组未处理的人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2在m RNA表达谱的分析中发现,TRPP2m RNA表达显著减少,为进一步验证TRPP2是否参与肿瘤坏死因子α对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的影响过程,我们进行了进一步的机制研究。本研究结果表明肿瘤坏死因子α通过抑制TRPP2的表达调节PERK-e IF2α信号通路以及TRPP2介导的钙离子通道途径增强了Hep-2细胞的增殖。主要结果如下:(1)肿瘤坏死因子α能显著减少人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的TRPP2的表达和ATP引发的钙离子释放。(2)si RNA特异敲低TRPP2可显著抑制ATP引发的钙离子释放、消除肿瘤坏死因子α对ATP引发的钙离子释放减少的效应。(3)人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞经过肿瘤坏死因子α处理或特异敲低TRPP2处理未影响IP3R-I表达水平和细胞内基础钙离子浓度。但肿瘤坏死因子α处理和特异性敲除TRPP2对抑制TRPP2的表达有增强效应。(4)肿瘤坏死因子α处理增强了人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖及G2/M期的比例,但是减少了G0/G1的比例。而si RNA特异敲低TRPP2后,人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖也增加,其表现为S期和G2/M期比例增加,但G0/G1期细胞比例减少。(5)肿瘤坏死因子α显著下调p-PERK和p-e IF2α的表达水平,但不影响PERK和e IF2α的表达水平。