羰基还原酶即醇脱氢酶,可以催化醇和酮或醛之间的相互转化。(3R,55S-6-氯-二羟基己酸叔丁酯是合成他汀类药物中的一种重要的手性中间体,例如瑞舒伐他汀和阿托伐他汀。因此,本研究通过基因组挖掘的方法从产酸克雷伯菌Klebsiellaoxytoca中发现了一种新型的羰基还原酶KleADH,并对其进行了克隆表达和性质测定。将羰基还原酶KleADH克隆到pet-28载体质粒上,在大肠杆菌Rosetta (DE3)中进行表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其表达出了大小为30 KDa左右的目的蛋白。重组后的全细胞用于催化(S)分6-氯-5-轻基-3-氧代己酸叔丁酯生成(3R,5S)-6-氯-二羟基己酸叔丁酯。反应24 h后,其非对映体选择性(d.e)和转化率都达到了 99%以上,且反应无需添加昂贵的辅因子。使用Discovery Studio 2.5对KleADH进行同源建模,完成酶与底物对接实验,得到了 KleADH与底物复合物的三维结构。为了确定KleADH的催化中心,我们对Asp44、Tyr49、Lys74和His107这几个氨基酸残基进行了“丙氨酸扫描”实验,突变体转化到大肠杆菌Transetta感受态细胞中,诱导目的蛋白的表达。实验结果符合预期,突变体全部失去了原有的活性,证明Asp44、Tyr49、Lys74和His107组成了 KleADH的活性中心。对影响全细胞催化活性的因素进行了研究,包括温度、pH、金属离子和有机溶剂对酶活的影响。实验表明在30℃,pH 7.0的条件下酶的活性最高。终浓度为0.1 mM的Mg2+能使酶活性提高至1.45倍,金属离子对酶活的影响与浓度有很大的关系。两相系统正己烷/水和正庚烷/水能显著提高羰基还原酶KleADH催化不对称还原反应的速率。底物特异性的研究显示该羰基还原酶KleADH对几种芳香酮类化合物也具有显著的活性和较高的立体选择性。这种新型羰基还原酶KleADH的发现为制备手性醇类化合物提供了新的方法,对于手性醇类药物的制备具有潜在的意义及应用价值。