随着化石燃料资源的枯竭与环境问题的日益严峻,生物燃料有望成为未来代替化石燃料的新能源。与传统生物燃料(燃料乙醇)相比,异丁醇具有不易吸水、挥发性低、辛烷值高和能量密度大等特点,使其成为潜在的新一代可再生能源。目前,利用微生物以葡萄糖基质生产异丁醇尚未达到工业化水平。运用基因工程手段对宿主菌进行改造使其能够合成乃至高产异丁醇成为重要的研究方向。在异丁醇生物合成过程中乙醇脱氢酶和2-酮酸脱羧酶是整个过程中的两个关键酶。由于大肠杆菌中缺乏2-酮基酸脱羧酶无法将前体物质2-酮基酸转化成相应的醛,因而不能产生异丁醇。本文旨在通过基因改造,在大肠杆菌中引入异丁醇代谢外源途径,使大肠杆菌能够合成异丁醇。本实验先以酿酒酵母总DNA作为模板,通过PCR扩增得到了乙醇脱氢酶基因(adh2),加A后连接到pMD18-T载体上；测序验证无误后,通过酶切连接到表达载体pSTV-29上,形成重组质粒pSTV-29然后,将重组质粒pSTV-29-adh2转化到大肠杆菌DH5a中,经电泳分析乙醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达,成功构建出异丁醛的代谢途径。再以乳酸乳球菌总DNA作为模板,通过PCR扩增反应扩增得到了2-酮基异戊酸脱羧酶基因(kivd)。加A后连接到pMD18-T载体上,测序验证无误后,经酶切后连接到表达载体pSTV-29上,形成重组质粒pSTV-29-kivd。然后,将重组质粒pSTV-29-kivd转化到大肠杆菌DH5 a中,经电泳检测表明2-酮基异戊酸脱羧酶基因在大肠杆菌中表达,成功地构建出2-酮基异戊酸的代谢途径。然后构建串联表达质粒pSTV-29-adh2-kivd,并将其导入大肠杆菌DH5a中,构建产异丁醇基因工程菌。通过SDS-PAGE电泳分析表明：串联基因adh2、kivd的蛋白得到表达；重组菌株经IPTG诱导,在含10%葡萄糖LB培养基中于37℃,200rpm培养24h,通过气相色谱检测,异丁醇的产量为0.14g/L。本实验成功地将adh2基因和kivd基因串联地引入了大肠杆菌中,在大肠杆菌中构建出了一条代谢葡萄糖生成异丁醇的途径。