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在反刍动物中,短链脂肪酸(Short chain fatty acid,SCFAs)能够为奶牛和绵羊提供约70%的能量来源,它是由瘤胃微生物快速发酵日粮中碳水化合物产生的,约占总SCFAs的95%。添加高精料能够快速被瘤胃微生物发酵产生高浓度的SCFAs并提供能量和提高奶牛的产奶量,然而,也会引起快速的炎症反应。之前的研究已经报道,SCFAs能够调节小鼠结肠上皮的炎症反应。此外,G-蛋白偶联受体41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)是SCFAs的受体。我们推测作为反刍动物主要能量来源的SCFAs是否能够通过GPR41来调控奶牛瘤胃上皮炎症反应有待进一步研究。在研究GPR41是如何调控奶牛瘤胃上皮炎症机制之前,我们必须获得稳定连续传代的奶牛瘤胃上皮细胞系(Bovine rumen epithelial cells,BRECs)。然而,永生化的BRECs系还未被建立。因此,本研究目的是首先建立永生化的BRECs系,其次深入探讨SCFAs是否能通过GPR41调控BRECs的炎症反应,为研究GPR41在BRECs炎症反应潜在的调控机制提供理论依据。试验一、永生化奶牛瘤胃上皮细胞系建立在反刍动物中,奶牛瘤胃上皮细胞对于短链脂肪酸的吸收和代谢扮演至关重要的作用。一个连续传代的BRECs对于通过CRISPR/Cas 9系统研究基因的功能是一个有用的细胞素材。然而,永生化的BRECs并未被报道。因此,本试验目的是为了建立一个永生化的BRECs。瘤胃上皮组织是来自于3头青年牛,并通过一系列的酶消化获得原代BRECs。通过SV40T抗原整合至BRECs基因组中使BRECs永生化。永生化BRECs保持典型的上皮型和鹅卵石形态并在4天培养之后,细胞密度能够达到100%。永生化BRECs能够快速地增殖并未显示任何的衰老信号。同时,那些细胞具有表达细胞角蛋白18、monocarboxylate transporter 1(MCT1)、MCT4、Na+/H+ exchanger 1(NHE1)、NHE2、NHE3 和 GPR41 的特征。与 pH 7.4相比,pH 5.5能够显著增加BRECs对丙酸的吸收。综上所述,我们已经建立了永生化的BRECs,这个细胞系能够进一步研究SCFAs的吸收、代谢、细胞增殖和分化相关功能性基因的分子机制。试验二、SCFAs对相关短链脂肪酸转运蛋白和GPR41表达影响本试验旨在研究不同pH和SCFAs对相关SCFAs转运蛋白和GPR41表达影响。试验分为6个组:培养基pH 6.2、pH 6.8和pH 7.4分别细胞培养24 h;pH 6.2培养基含20 mM SCFAs、pH 6.8培养基含20 mM SCFAs和pH 7.4培养基含20 mM SCFAs各自细胞培养24 h,每组3个重复。培养24 h之后,细胞被收集提取细胞总RNA。结果表明,添加SCFAs条件下,pH 6.2、pH 6.8和pH 7.4之间的MCT1表达量差异不显著(;p>0.05)。pH 6.8且添加SCFAs条件下,MCT1的表达量显著高于缺乏SCFAs pH 6.8和pH 7.4试验组(p<0.05)。添加SCFAs条件下,pH 6.2的MCT4的表达量显著高于pH 6.8和pH 7.4(p<0.01)。添加SCFAs条件下,MCT4的表达量显著高于缺乏SCFAs(p<0.01)。添加SCFAs条件下,NHE1、NHE2和NHE3表达量显著高于缺乏SCFAs时的表达量(p<0.01)。随着pH的降低,NHE1、NHE2和NHE3的表达量逐渐上调。缺乏SCFAs条件下,GPR41不能够表达。添加SCFAs之后,能够显著激活GPR41的表达。与pH 7.4相比,pH 6.8能够显著上调GPR41的表达量(p<0.05)。结果证明,低pH和SCFAs能够显著加强相关SCFAs转运蛋白和GPR41的mRNA表达量。试验三、转录组分析SCFAs诱导BRECs的mRNA的差异基因和差异信号通路本试验旨在利用转录组测序技术来研究SCFAs刺激BRECs后mRNA的差异基因和差异信号通路。试验分为2个组:培养基pH 6.2细胞培养24 h;pH 6.2培养基含20 mM SCFAs细胞培养24 h,每组3个重复。结果表明,添加SCFAs诱导BRECs之后4011个基因被显著上调,1431个基因被显著下调(p<0.05)。通过SCFAs诱导BRECs之后,促炎症因子IL-1β 和 TNF-α 显著上调。此外,CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8 和 CXCL14趋化因子表达水平被显著上调(p<0.01)。钙离子信号通路中关键分子PLCβ2和IP3R1被显著上调(p<0.01)。此外,SCFAs能够显著激活BRECs的MAPK信号通路、Cytokine-cytokine receptor interaction信号通路和Ca2+信号通路。结果证明,SCFAs能够激活BRECs炎症反应和Ca2+信号通路。试验四、SCFAs对BRECs的促炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响本试验旨在通过qRT-PCR和Western blotting来验证转录组的相关结果以及不同浓度的SCFAs和不同时间点对BRECs的促炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达的影响。结果表明,qRT-PCR的结果与转录组的试验结果一致,SCFAs能够促进BRECs的促炎症因子、趋化因子和Ca2+信号通路相关分子的表达。此外,SCFAs诱导BRECs炎症反应涉及p-Erk1/2 MAPK信号分子的激活,但不是涉及NF-κB信号通路。高浓度的SCFAs能够加强促炎症因子IL-1β和TNF-α的表达,但下调CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL8趋化因子和紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达量。培养至72 h时,促炎症因子IL-1β显著高于 24 h 和 48 h(p<0.05)。与 48 h 相比,培养至 72 h,Occludin、Claudin-1 和 ZO-1的表达量被下调,但差异不显著。这些结果提示,随着时间的延长,能够引起BRECs促炎症反应和抑制紧密连接蛋白的表达。这个结果证明,高浓度的SCFAs引起BRECs的促炎症反应和破坏BRECs的免疫趋化和免疫屏障功能。试验五、GPR41调控BRECs炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白的表达本试验旨在通过CRISPR/Cas 9系统敲除GPR41进一步深入研究GPR41是否能够调控BRECs的炎症因子、趋化因子、紧密连接蛋白的表达和Ca2+信号通路。试验分为3个组:培养基+BRECs、含20 mM SCFAs培养基+BRECs和含20 mM SCFAs培养基+敲除GPR41基因的BRECs,各自培养细胞24h,每组3个重复。结果表明,在gRNA1和gRNA3共同切割靶位点的作用下,GPR41基因的第一个外显子被删除142bp。与野生型相比,敲除GPR41之后,GPR41的表达量显著下调了 2.7倍(p<0.05)。与野生型相比,敲除GPR41之后,促炎症因子IL-1β和TNF-α的表达量被显著上调(p<0.05)。然而,CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8和CXCL14趋化因子以及紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达量被下调(p<0.05)。此外,涉及Ca2+信号通路关键分子IP3R1的mRNA表达量被显著下调(p<0.05)。这个结果证明,GPR41下调引起BRECs的促炎症反应,但减少BRECs的趋化因子和免疫屏障相关基因的表达量。