人细胞色素P450CYP2A13介导下姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖的影响

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目的:用不同浓度的姜黄素作用于肺腺癌A549空载体细胞株(A549CYP (-))和肺腺癌A549过表达株(A549CYP),观察姜黄素对A549CYP (-)和A549CYP细胞增殖的作用和周期的影响,检测对细胞中Bax和Bcl-2基因表达水平和蛋白表达水平的影响。为探讨姜黄素抗肿瘤的作用机制及潜在的临床治疗方案提供新的理论基础。方法:(1)MTT(四氮唑蓝)法检测A549CYP(-)与A549CYP生长5天的吸光度值:取处于对数生长期的两组细胞,以2×103/孔接种于96孔板,每天各取3孔加入20μL (5mg/mL) MTT溶液,继续培养4h后每孔加入DMSO200μL,使结晶充分溶解。连续5天观察两种细胞生长情况。(2)MTT法检测不同浓度姜黄素作用后A549CYP(-)与A549CYP细胞的生长情况:取对数生长期的A549CYP(-)和A549CYP细胞接种于96孔板,调整细胞浓度至2×104/mL,每孔2001μL。分别选取姜黄素终浓度为(0、5、10、20、40)μg/mL的培养液作用于A549CYP (-)和A549CYP细胞,每个浓度设6个复孔。将培养板置于37℃,5%C02细胞培养箱中孵育48小时后,采用MTT法检测计算细胞增殖抑制率,用酶标仪测定490nnm处吸光度值。(3)分别用不同浓度的姜黄素(0、10、40) μg/mL的培养液作用于A549CYP(-)和A549CYP细胞48小时,应用流式细胞术PI染色法检测在不同条件作用下细胞的细胞周期变化情况。(4)用实时荧光定量PCR法检测不同浓度的姜黄素(0、10、40)的培养液作用于A549CYP(-)和A549CYP细胞48小时,细胞中Bax和Bcl-2基因表达水平的变化情况。(5)应用蛋白质印记(Western blot)技术检测在不同姜黄素浓度(0、10、40)干预48小时后,细胞内Bax和Bcl-2的蛋白水平表达情况。结果:(1)MTT法检测连续5天增殖的两组细胞生长情况显示:两组细胞增殖速率的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)MTT法测定在不同浓度的姜黄素干预48小时后A549CYP(-)和A549CYP细胞的存活和生长情况显示:①随着浓度的增加姜黄素对细胞生长的抑制愈加明显,两对照组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②同一浓度不同细胞之间两两比较,差异显著,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)用流式细胞仪检测细胞周期分布情况显示:在不同浓度的姜黄素干预48小时后,A549CYP(-)和A549CYP细胞的细胞周期中G1期细胞百分比均随着姜黄素浓度的升高而增加(P<0.05),不同细胞两对照组之间相比升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05);相同浓度之间实验组两两对比,A549CYP(-)细胞组比A549CYP细胞组G1期细胞百分比升高明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)实时荧光定量PCR结果显示:①不同浓度的姜黄素作用于A549CYP(-)和A549CYP细胞48小时后,细胞中Bax基因的表达水平均上调,Bcl-2的基因表达水平均下调。②两对照组之间比较,Bax和Bcl-2的基因表达水平无显著性差异(P>0.05),实验组不同细胞同一药浓度之间两两比较差异明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)姜黄素处理A549CYP(-)和A549CYP细胞48小时后,用Western blot技术检测Bax和Bcl2的蛋白表达水平。结果表明,经姜黄素处理,对照组的两种细胞Bax和Bcl-2的表达水平无显著性差异(P>0.05),随着姜黄素浓度的增加,Bax的表达上调,Bcl-2的表达下调,同一浓度不同细胞之间两两比较,Bax和Bcl-2的蛋白表达水平差异明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:①人肺腺癌A549CYP(-)和A549CYP这两种细胞在没有药物干预的情况下,生长速度无明显差别,CYP2A13基因并未对细胞的增殖产生影响。②采用药物姜黄素对人肺腺癌A549CYP(-)和A549CYP细胞进行干预48小时后发现,姜黄素对这两种细胞的增殖均有明显的抑制作用,且对肺腺癌A549CYP(-)细胞的抑制作用明显强于A549CYP细胞,可能是P450CYP2A13代谢了姜黄素从而减弱了其抗癌作用。③姜黄素作用于人肺腺癌A549CYP(-)和A549CYP细胞48小时后,通过使这两种细胞均阻滞在G1期来实现对细胞增殖的抑制作用。④姜黄素通过上调Bax基因的表达和下调Bc12基因的表达,对细胞增殖产生抑制作用。
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