心血管疾病是目前威胁人类生命健康的头号杀手，其发病率和死亡率逐年升高，引发心血管疾病的原因有很多，包括心肌缺血/再灌注损伤，高脂血症，动脉粥样硬化，肿瘤药物毒副作用等等。随着现代医学的发展，心血管疾病的防治、诊断和治疗均取得了一定的进展，但由于心血管疾病发病率高、治愈率低、并发症多，给心血管疾病的防治工作带来了更大的挑战。传统中药及中药复方在心血管疾病防治中的应用引起了医药界的广泛关注。因此选取确有疗效的中药及复方，深入研究其对心血管疾病的防治机制，明确其药效物质基础和作用特点，对于研发治疗心血管疾病的药物具有重要的意义和临床价值。　　 本课题选择临床有效方剂冠心丹参方及具有心血管活性的黄酮类成分进行了心肌保护作用的活性筛选及分子机制研究。课题共分为二部分:　　 第一部分冠心丹参方中心肌保护活性成分筛选及分子机制研究　　 实验目的:冠心丹参滴丸为本课题组自主研发治疗冠心病的有效方剂，由丹参、三七、降香三味药组成，具有活血化瘀、行气止痛等功效，临床观察证实冠心丹参滴丸治疗冠心病、心绞痛疗效确切。尽管冠心丹参方的临床疗效已经得到肯定，且近十年来，关于冠心丹参方心肌保护作用的药效物质基础的研究取得了一定的进展，但由于中药复方中成分复杂，目前的研究仍然不能完全阐明该方的有效成分及作用靶标。本课题通过对冠心丹参方中的主要成分进行系统的筛选，从中发现具有治疗价值的心肌保护中药活性成分，同时进一步对其分子作用机制进行深入研究。为防治心血管疾病提供良好的候选新药和临床前研究数据，同时为从现代分子生物学水平上阐明中药复方有效性及作用机理提供实验依据。　　 实验方法:对冠心丹参方中的9种主要成分在H9c2心肌细胞缺氧复氧模型上进行活性筛选。并进一步运用多重检测手段（Caspase-3荧光活性检测法，Hoechst33342/PI荧光染色法，TUNEL染色法，Western blot蛋白免疫印迹法等）深入阐释其主要活性成分人参皂苷RK3的心肌保护作用机制。　　 实验结果:1.冠心丹参方中各主要成分在H9c2心肌细胞缺氧复氧模型上均具有不同程度的保护作用，其中皂苷类化合物人参皂苷RK3的活性较强，在6.25～25μg/mL浓度范围内对缺氧复氧引起的心肌细胞活力的下降具有浓度依赖性显著的抑制作用。2.25μg/mL人参皂苷RK3预处理可显著抑制缺氧复氧引起的Caspase-3酶活性的增加，降低TUNEL凋亡细胞的比例，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2，降低促凋亡蛋白Bax的表达。进一步的研究显示，人参皂苷RK3的心肌保护作用与PI3K/AKT和MAPK信号转导通路有关。　　 结论:在缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤模型上，三七中皂苷类化合物人参皂苷RK3的心肌保护作用较强。人参皂苷RK3可通过激活PI3K/AKT生存通路及调节MAPK信号转导通路对缺氧复氧引起的H9c2细胞凋亡发挥保护作用。　　 第二部分黄酮类化合物心肌保护活性成分筛选及分子机制研究　　 实验目的:黄酮类化合物是中药中用于治疗和预防心血管疾病的重要有效成分。流行病学研究证明饮食中大量摄入黄酮类化合物能够降低心血管疾病的发生率和死亡率。突出显示出黄酮类化合物在预防和治疗心血管疾病中具有潜在应用价值和巨大的药用开发前景。本课题组在对冠心丹参滴丸的研究中发现黄酮类化合物抗氧化活性最显著，是冠心丹参方中发挥抗氧化活性的主要部位。因此本课题进一步选择9种天然黄酮类成分为研究对象，从中发现具有心肌保护作用和治疗价值的活性成分并对其作用机制进行深入研究。该研究对于揭示黄酮类化合物心肌保护内在分子机制具有重要的科学意义，同时为黄酮类化合物的应用提供科学依据。　　 实验方法:对9种黄酮类化合物在阿霉素心肌损伤模型上进行活性筛选。结合病理学技术（HE染色，免疫组织化学等），生化指标（心肌酶，脂质过氧化产物，抗氧化酶），荧光染色（H33342/PI双染、TUNEL染色、ROS及JC-1染色等）以及细胞分子生物学技术（western blot等），从整体动物水平，细胞水平和分子水平对活性成分异鼠李素的心肌保护作用及机制进行深入全面的研究。　　 实验结果:1.九种黄酮类化合物中，除大豆苷元和樱黄素外，其它成分均能在一定程度上保护阿霉素诱导的心肌毒性，其中异鼠李素的心肌保护活性较强，在3.125～25μg/mL浓度范围内对阿霉素引起的心肌细胞活力的下降均具有显著的抑制作用，当浓度为12.5μg/mL时，心肌保护作用最显著。2.体内实验中，大鼠腹腔注射5mg/kg异鼠李素可以显著降低阿霉素诱导的大鼠血清中心肌酶CK，AST和乳酸脱氢酶LDH的活性，增强抗氧化物酶SOD，GSH-Px，CAT的活性，抑制TUNEL凋亡细胞率、减少Caspase-3的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2，下调促凋亡蛋白Bax，抑制P53的表达。3.体外实验中，12.5μg/mL异鼠李素可以显著增强抗氧化物酶的活性，抑制细胞内ROS的生成、抑制Caspase-3的激活，减少TUNEL凋亡细胞数，进一步的研究显示，异鼠李素的抗凋亡作用与抑制线粒体凋亡通路和MAPK信号转导通路有关。4.阿霉素和异鼠李素共孵育对MCF-7、HepG2、Hep2肿瘤细胞的增殖抑制和促进凋亡作用显著强于两药单独使用的作用。　　 结论:黄酮类化合物异鼠李素在阿霉素心肌损伤模型上具有较好的心肌保护作用，其机制与抑制氧化应激、线粒体凋亡通路和MAPK信号转导通路有关。本研究为防治化疗药物引起的心血管疾病研究提供了良好的候选新药和临床前研究数据。