橘小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）是一种重要的检疫性有害生物,其食性杂、寄主范围广、繁殖力强、传播快、适生性强、潜在分布区大且防治困难。生殖力强大是橘小实蝇持续繁殖,造成严重危害的重要原因之一。因此,通过分子生物学手段来研究橘小实蝇雌虫生殖调控相关基因的功能,可为橘小实蝇的绿色可持续防控提供新靶标和新思路。本研究从实验室已有的橘小实蝇转录组文库中鉴定到一个在性成熟时期的卵巢组织中高表达的蛋白酶体beta3亚基类似物基因（Proteasome Subunit beta type-3-like,pts）,对其进行了同源比对和系统进化分析,进一步采用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术明确了其时空表达模式,然后通过RNAi技术研究pts对橘小实蝇雌成虫卵巢发育、产卵量等生殖力的影响,为揭示pts基因调控橘小实蝇生殖发育的分子机理提供理论基础。1.pts基因鉴定与生物信息学分析我们从实验室已有的橘小实蝇转录组文库中鉴定到一个在橘小实蝇性成熟阶段高表达的pts基因,获得了其全长c DNA序列,大小为615bp,编码205个氨基酸,其编码区与马来西亚实蝇Bactrocera latifrons、橄榄实蝇Bactrocera oleae以及瓜实蝇Bactrocera cucurbitae的序列同源性均较高,分别为97%、95%和92%系统进化分析表明其与地中海实蝇Ceratitis capitata同源序列进化距离最近。2.时空表达模式研究实时荧光定量PCR对其时空表达模式研究发现:pts基因在橘小实蝇卵期和性成熟时期雌虫中的相对表达量显著高于幼虫、蛹期及初羽化时期;在性成熟成虫卵巢组织中的相对表达量显著高于其它组织的相对表达量四倍左右;羽化后不同天数的卵巢中第7天的卵巢中表达量显著提高并维持高表达量;羽化后不同天数的脂肪体中整个生殖发育时期相对表达量呈逐渐上升的趋势。我们通过免疫印迹技术在蛋白水平对其表达模式进行了研究,在卵巢和脂肪体组织中的PTS蛋白含量明显高于其它组织的含量,其他总体趋势与转录水平大体一致。3.pts基因在橘小实蝇雌虫生殖发育中的功能研究为进一步确定pts基因在橘小实蝇生殖发育中的功能,通过RNAi沉默该基因后,观察橘小实蝇生殖发育相关行为及生殖力。结果表明,沉默该基因后,约有1/2的雌成虫出现卵巢发育迟缓的现象,明显小于正常发育的卵巢体积,且处理组雌虫的平均总产卵量、日均产卵量以及交配率都有显著下降,但卵粒的孵化率并没有显著差异。为了明确pts基因调控橘小实蝇生殖发育的分子机理,我们通过实时荧光定量PCR技术检测了沉默pts基因后脂肪体中的卵黄原蛋白基因Vg1、Vg2以及卵黄原蛋白受体基因yolkless的表达量,发现这些基因表达水平与对照组相比都有显著下调。此外,我们提取干扰后第3天的橘小实蝇卵巢、脂肪体以及血淋巴三个与卵黄原蛋白相关的组织总蛋白,发现沉默pts基因后PTS蛋白表达量显著下调,并且干扰组卵巢中Vg蛋白表达量显著下降,而脂肪体和血淋巴中Vg蛋白表达量没有明显变化。这些结果表明,沉默pts基因影响了卵巢中的卵黄沉积,而对Vg蛋白的体液运输过程没有影响。综上所述,pts基因可能通过影响橘小实蝇卵黄原蛋白合成与卵黄沉积作用参与调控卵巢发育与产卵量,进而影响雌虫的生殖发育。