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[目 的]急性髓系白血病（AML）是一类常见的髓系造血细胞克隆性增殖的恶性血液病。AML复发率和死亡率居高不下的主要原因是化疗过程中耐药和治疗后易复发。目前AML的诊断和病情评估手段单一,不利于早期诊断及精确病情评估,而且AML的发病机制复杂,尚未阐明。有研究表明AML细胞衍生释放外泌体,这些外泌体可以介导细胞之间的通讯,导致靶细胞环境之间相互串扰并影响肿瘤相关过程。本课题从疾病样品出发,收集确诊的AML血清样本及健康对照组样本,提取外泌体,通过定量蛋白质质谱筛选在AML病人血清中特异性、高度富集的外泌体蛋白质,作为研究AML细胞来源的外泌体与疾病发生和转移的分子机制的切入点,验证所筛选获得的蛋白质在临床样本中表达情况,并针对鉴定出的差异蛋白进行功能研究。为AML的早期诊断和预后评估,以及临床耐药、治疗策略的研究提供理论基础。[方 法]1.收集昆明医科大学第二附属医院血液内科门诊或住院部确诊为AML的患者（发病期）血清80mL,同时期健康体检者血清100mL。超速离心法提取血清外泌体,通过透射电镜、western-blot进行鉴定。TMT标记定量质谱分析提取的外泌体的蛋白质组成,对差异表达的蛋白质进行Gene Ontology（GO）分析、KEGG信号通路分析;2.ExoQuick试剂盒提取AML患者及健康体检者血清外泌体,通过扫描电镜、NTA、western-blot进行鉴定,采用western-blot方式检测筛选获取的差异表达蛋白质的表达量,并结合临床资料分析;采用western-blot检测筛选获取的差异表达蛋白质在样本中的定位;3.体外培养OCI-AML3、THP-1、HL60白血病细胞株及HUVEC细胞株,ExoQuick试剂盒提取AML血清外泌体与其共培养,采用CCK8、Annexin V/PI、细胞周期实验、成管实验研究血清外泌体对受体细胞生物学表型的影响;在OCI-AML3细胞株中慢病毒干扰FN,提取下调FN的细胞株衍生的外泌体,通过透射电镜、NAT、western-blot对细胞外泌体进行鉴定,将外泌体与AML细胞株共培养,CCK8、Annexin V/PI探究外泌体FN蛋白对肿瘤细胞的生物功能的影响。[结 果]1.外泌体鉴定:透射电镜下外泌体为类圆形囊泡,Western-blot结果显示外泌体呈现CD63阳性,与经典的外泌体鉴定结果一致。蛋白质定量质谱:共检测出146个差异表达的外泌体蛋白,AML患者血清中有89个蛋白表达上调,57个蛋白表达下调。生物信息学分析提示,差异表达的蛋白与机体的免疫反应密切相关,同时涉及到血细胞的生长、增殖、分化、脱颗粒及整个细胞周期,还涉及机体造血、止凝血等生物学过程。差异表达蛋白在25条生物通路中显著富集,与细胞的增殖、迁移、凋亡相关。2.外泌体鉴定:扫描电镜显示为类圆形囊泡,Western-blot结果显示外泌体呈现CD63、TSG101阳性,NTA显示血清外泌体浓度均值为1.2x107/ml,外泌体直径峰值为145.5nm,与经典的外泌体鉴定结果一致。临床样本验证结果显示:筛选获得的差异表达蛋白Clu、FN、ANG在AML患者血清中表达量高于健康对照组（p<0.001）,ACTN4在AML患者血清外泌体中表达量低于健康对照组（p<0.001）,与质谱结果一致。FN、ANG蛋白在AML不同型（M1-5、M7）患者血清外泌体中差异表达。Clu、FN、ANG在同一 AML患者血清、外泌体中显著表达,但在提取外泌体后的上清液中未检测到,说明Clu、FN、ANG几乎全部包装在外泌体中。3.利用AML患者血清外泌体刺激急性髓系白血病细胞系OCI-AML3、THP-1、HL60和脐静脉内皮细胞系HUVEC,CCK-8实验结果显示:AML血清外泌体可以促进AML细胞的增殖（p<0.05）,且外泌体浓度为200ug/ml时的增殖作用比100ug/ml强,对HUVEC细胞同样具有促进增殖作用（p<0.05）;流式结果显示:血清外泌体刺激的实验组与对照组相比细胞凋亡率明显减少（p<0.05）;周期结果显示:血清外泌体刺激的实验组与对照组相比G2期细胞明显减少,血清外泌体作用于AML细胞株后通过缩短G2期从而促进细胞增殖。4.利用慢病毒在OCI-AML3细胞株中干扰FN后,提取FN下调的细胞株的外泌体,提取的外泌体与OCI-AML3、THP-1、HL60细胞株共培养,CCK-8实验结果显示:干扰组相比对照组细胞增殖受到抑制（p<0.05）,流式结果显示:干扰组相比对照组细胞凋亡率明显增加（p<0.05）。[结 论]1.AML血清外泌体中富含大量蛋白质,且AML患者与健康对照组血清来源的外泌体的蛋白质谱存在显著差异,生物信息学分析提示差异表达蛋白质主要介导免疫反应,与细胞的增殖、迁移、凋亡相关。2.筛选的差异表达外泌体蛋白Clu、FN、ANG在AML患者血清来源外泌体中高表达,ACTN4低表达;差异表达蛋白质FN、ANG在AML不同分型中差异表达,其表达量与AML分型密切相关;提示AML血清外泌体有成为AML体外诊断及分型的生物标志物的潜能。3.Clu、FN、ANG在提取外泌体后的上清液中检测不到,其几乎全部包装在外泌体中;且FN、ANG的表达量与AML疾病进展、细胞遗传学密切相关,提示AML血清外泌体蛋白质是理想的体外活检生物标志物,且其表达量可与细胞遗传学分层一起运用于AML患者的预后评估。4.AML血清外泌体作用于受体细胞,通过促进AML细胞的增殖、抑制凋亡、干扰AML细胞周期参与AML的进展;通过促进内皮细胞增长、内皮细胞成管,参与AML血管的生成。5.外泌体蛋白FN通过促进AML细胞增殖、抑制AML细胞凋亡从而参与AML发生发展的调控。