研究目的：全球大约有4亿HBV病毒携带者,HBV感染可以导致肝硬化、肝纤维化甚至肝癌。尽管在HBV急性感染过程中,机体的天然免疫和获得性免疫可以活化并清除病毒,但是在HBV慢性感染中,HBV的持续存在抑制了机体的天然免疫和获得性免疫,诱导机体的肝细胞内源性免疫耐受和系统性免疫耐受,甚至导致CD8+T细胞耗竭。CD8+T细胞,尤其是肝脏HBV特异性CD8+T细胞,在清除HBV病毒中发挥了重要作用。CD8+T细胞可以通过分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α来抑制HBV的复制转录。但是在CHB病人中,CD8+T细胞的增殖能力和抗病毒能力均受到明显抑制,其分泌细胞因子的能力较低,同时又高表达共抑制分子(例如PD-1,Tim-3,CTLA-4),导致CD8+T细胞呈明显低能、缺如乃至耗竭状态。共抑制分子受体PD-1,不仅可以通过募集SHP2直接抑制TCR信号通路,还可以向CD8+T细胞传递死亡信号,促进其凋亡。而其重要的配体PD-L1,广泛表达于多种细胞表面,通过与PD-1相互作用向CD8+T细胞传递抑制信号。研究表明,在CHB病人中,PD-L1的水平明显高于健康人,这说明PD-L1参与了HBV诱导机体免疫耐受的进程。但是HBV上调肝细胞表面PD-L1的机制还不清楚。HBV诱导的免疫耐受为HBV的治疗带来巨大挑战,因此逆转HBV诱导的肝细胞内源性免疫耐受,重建系统性免疫系统,对更好的治疗HBV感染具有重要意义。而实现这一目的的一个可行策略不再仅仅局限于对病毒生命周期的直接阻断,而是在抑制肝细胞HBV复制的同时,激活机体的免疫反应。本实验室前期研究发现,5’-triphosphate-siRNAs (3p-siRNAs)不仅可以靶向沉默特定基因(如病毒转录本或者癌基因),又可以通过RIG-I通路激活免疫反应,产生双重的抗病毒或者抗肿瘤效果,也同样能够在肝细胞内逆转HBV诱导的肝细胞内源性免疫耐受,相比单纯的RNAi方案具有更加明显的疗效。在本研究中,我们分别在细胞系、临床肝癌标本和通过尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒建立的HBV持续性感染模型体内观察到HBV感染可以诱导肝细胞内源性免疫耐受,而这种内源性免疫耐受可以进一步诱导全身系统性的免疫耐受,包括HBV特异性CD8+T细胞活化、功能和应答能力的降低及B细胞产生抗HBs抗体应答能力的低下。继而,我们构建了一种能够同时表达靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反应的ssRNA的双表达载体。我们发现该双表达载体可以逆转HBV诱导的肝细胞内源性免疫,并恢复机体的系统性免疫应答能力,进而发挥很好的抑制和清除HBV的效应。在抑制和清除HBV的过程中,CD8+T细胞发挥了关键作用,且依赖于TLR7通路和I型干扰素信号通路。另一方面,鉴于PD-1/PD-L1信号通路在HBV诱导的CD8+T细胞耗竭中发挥重要作用,我们通过生物信息学预测了潜在靶向PD-L1的多种miRNAs,通过将化学合成的模拟物或抑制物转染到细胞中,发现niR-200c可以下调PD-L1的表达。经萤光素酶报告基因实验证实,miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3UTR。更为重要的是,在HBV阳性小鼠体内过表达miR-200c,不仅可以促进耗竭性CD8+T细胞功能的恢复,还可以抑制HBV的复制和转录。方法：一方面,我们利用定量PCR比较了HepG2.2.15和HepG2、HBV+HCC和HBV-HCC、HBV+和HBV-小鼠原代肝细胞中1型干扰素及其诱导基因的表达水平；并用Western blot进一步证实。接着,我们利用流式细胞术检测HBV阳性小鼠淋巴细胞的分群和活化,利用ELISA检测HBV阳性小鼠血清中的细胞因子水平。为了更好的治疗HBV感染,我们构建了一种能够同时表达靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反应的ssRNA的双表达载体(dual),并确认了其对HBV的直接沉默能力和激活天然免疫信号传导的能力。经过双表达载体治疗后,我们检测了小鼠肝细胞和血清中细胞因子的表达和分泌水平以及CD8+T细胞的活化水平和分泌IFN-γ的能力。同时,我们利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了双表达载体治疗对小鼠血清中HBV DNA和HBsAg水平的影响。为了研究CD8+T细胞在双表达载体抑制HBV复制过程中的作用,我们分别利用清除性抗体清除小鼠体内的CD8+T细胞及将CD8+T细胞过继转输到缺失T细胞的Rag-1-/-HBV阳性小鼠体内,并观察双表达载体对HBV DNA和HBsAg的影响。最后,通过中和I型干扰素受体和抑制TLR7信号通路,观察其对双表达载体活化CD8+T细胞和抑制HBV复制的影响。另一方面,我们利用流式细胞术比较了HepG2.2.15和HepG2、HBV+和HBV一小鼠原代肝细胞表面PD-L1的表达水平。随后,在HBV阳性小鼠体内,分别通过阻断PD-L1信号通路和过表达PD-L1,观察其对CD8+T细胞活化水平和分泌细胞因子能力的影响。为了研究是否有miRNAs参与了HBV上调PD-L1的进程,我们利用生物信息学预测了潜在靶向PD-L1mRNA的3’-UTR的多个miRNAs,并化学合成其模拟物和抑制物,通过体外转染的方式观察不同1niRNAs对肝细胞表面PD-L1表达的影响,初步证实miR-200c能够调控PD-L1的表达。并通过萤光素酶报告基因实验进一步证实,miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3’-UTR。最后,在HBV阳性小鼠体内过表达miR-200c,观察miR-200c过表达对CD8+T细胞功能及对HBV复制的影响。结果：一靶向HBx的双功能shRNA表达载体纠正肝脏内源性和系统性免疫耐受及其机制研究1HBV诱导肝脏细胞内源性和系统性免疫耐受利用定量PCR技术比较HepG2.2.15和HepG2、HBV+HCC和HBV-HCC、HBV+和HBV-小鼠原代肝细胞中基因表达的差异,我们发现HBV的持续存在可以抑制I型干扰素及其诱导基因的表达,而促进免疫抑制分子TGF-β和IL-10的表达。同时,Western blot实验和ELISA实验进一步证实了这一现象。这些数据表明,HBV感染可以诱导肝细胞内源性免疫耐受。同时,我们发现与正常小鼠相比,HBV阳性小鼠体内的肝脏CD8+T细胞的数量和比例明显偏低,并且其表面PD-1的表达水平明显升高,是正常小鼠的3倍。HBV特异性CD8+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例也明显低于正常小鼠。更重要的是,利用HBV疫苗对HBV阳性小鼠进行免疫后,并不能诱导产生大量的HBV特异性抗体。这些结果表明,HBV不仅可以诱导肝细胞内源性免疫耐受,还可以诱导机体系统性免疫耐受。2免疫刺激性的靶向HBx的双功能载体逆转HBV诱导的肝脏细胞内源性免疫耐受我们构建了一种能够同时表达靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反应的ssRNA的双表达载体(dual)。我们发现该双表达载体可以明显地诱导HepG2.2.15、HBV+HCC和HBV+小鼠原代肝细胞中Ⅰ型干扰素及其下游诱导基因的表达水平,同时抑制免疫负调分子TGF-β和IL-10的表达。同时,其在体外、体内实验中都具有很好的抑制HBV复制转录的能力。这些数据表明,dual可以很好的抑制HBV复制并成功逆转HBV诱导的肝细胞内源性免疫耐受。3逆转肝脏内源性免疫耐受可以打破HBV诱导的系统性免疫抑制HBV阳性小鼠注射双表达载体后,经过三次HBV疫苗免疫,其体内可产生大量特异性抗HBs抗体。同时,双表达载体治疗也可以上调肝脏CD8+T细胞的数量和活化水平,尤其是可显著增加HBV特异性CD8+T细胞的数量并增强其分泌细胞因子的能力。这表明该双表达载体可逆转肝细胞内源性免疫耐受,并进一步促进机体系统性免疫耐受的纠正,尤其是CD8+T细胞功能的恢复,最终增强机体抑制HBV复制的能力。进一步,我们利用抗体分别清除了小鼠体内的NK、CD4+T、CD8+T细胞,发现清除CD8+T细胞后,双表达载体对HBV的抑制效果受到严重削弱。同时,将CD8+T细胞过继转输到Rag-1-/-HBV阳性小鼠,双表达载体对受体鼠体内HBV的抑制作用显著增强。这些证据表明,CD8+T细胞在双表达载体抑制HBV复制中起关键作用。4TLR7-IFN-I在逆转系统性免疫耐受中具有重要作用我们利用中和抗体中和Ⅰ型干扰素受体,或者利用抑制剂抑制TLR7信号通路之后,进一步检测CD8+T细胞的活化水平和HBV复制情况。发现不管是中和Ⅰ型干扰素受体,还是抑制TLR7信号通路,都能明显降低CD8+T细胞的活化水平,并导致双表达载体介导的HBV复制抑制能力受损。这些结果表明,在双表达载体逆转HBV诱导免疫耐受并抑制HBV复制转录过程中,TLR7和Ⅰ型干扰素信号通路均发挥了重要的作用。二HBV通过下调肝细胞miR-200c表达诱导T细胞耗竭1HBV通过上调肝细胞表面PD-L1水平诱导CD8+T细胞耗竭首先,我们利用流式细胞术比较了HepG2、HepG2.2.15以及转染pAAV/HBV1.2质粒的HepG2细胞表面PD-L1的水平。结果显示,HBV可以上调肝细胞表面PD-L1的表达水平。同时,我们发现HBV阳性小鼠肝细胞表面的PD-L1的水平也高于正常小鼠。这些证据都表明,HBV感染后,肝细胞表面的PD-L1水平显著上调。为了进一步研究高水平的PD-L1在HBV诱导的免疫耐受中的作用,我们利用α-PD-L1阻断HBV阳性小鼠体内PD-L1/PD-1信号通路,进一步检测CD69+CD8+、IFN-γ+CD8+T细胞的比例。结果发现,阻断PD-L1/PD-1信号通路可促进CD8+T细胞的活化水平及其分泌细胞因子的能力。同时,过表达PD-L1可以降低CD8+T细胞的活化水平和分泌细胞因子能力。这些结果表明,高水平的PD-L1可以抑制CD8+T细胞的活化及其细胞因子分泌。2miR-200c直接靶向PD-L1的3’-UTR利用生物信息学手段,我们预测了靶向PD-L1mRNA3’-UTR的多个miRNAs(包括miR-200a, miR-200c和miR-383等),并化学合成这些miRNAs的模拟物和抑制物。通过体外转染的方式初步证实miR-200c能够调控PD-L1的表达。萤光素酶报告基因实验进一步证明,miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3’-UTR,进而浓度依赖性地下调PD-L1的水平。3HBV可以通过下调miR-200c水平而增强PD-L1的表达通过比较HepG2、HepG2.2.15、转染pAAV/HBV1.2以及HBV元件的质粒的HepG2中miR-200c的表达水平,我们发现HBV及HBs和HBx都可以显著下调miR-200c的表达水平。在HBV阳性小鼠肝细胞过表达miR-200c,可以逆转HBV上调PD-L1过程。这些结果表明,HBV感染可通过抑制肝细胞内1niR-200c的表达水平,进而增强肝细胞表面PD-L1的表达。4过表达miR-200c可以逆转HBV诱导的CD8+T细胞耗竭在HBV阳性小鼠中,miR-200c过表达可以明显增加CD69+CD8+和IFN-y+CD8+T细胞的比例,同时抑制CD8+T细胞的凋亡。此外,miR-200c过表达也可以增加HBV特异性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的比例。这些结果表明,miR-200c过表达可增强CD8+T细胞的功能。5过表达miR-200c可以抑制HBV阳性小鼠的HBV复制最后,我们发现miR-200c过表达可以明显降低HBV阳性小鼠血清中的HBVDNA和HBsAg,还可显著抑制肝脏组织中HBsAg、HBcAg的表达。这些结果表明,miR-200c可以增强CD8+T细胞的功能,进而降低HBV载量。结论及意义：1HBV可以诱导机体细胞内源性免疫耐受和系统性免疫耐受,进而促进HBV的存续。2我们构建的双功能载体可以通过逆转细胞内源性免疫耐受恢复机体的系统性免疫反应,并且具有很好的抑制HBV能力。在此过程中,CD8+T细胞具有重要作用,并且其功能的发挥依赖于TLR7和Ⅰ型干扰素信号通路。3本研究首次成功构建基于TLR7信号通路活化的兼具免疫刺激作用和靶向沉默作用的双功能shRNA表达载体,它不仅能有效地抑制HBV持续感染,还能逆转HBV诱导的肝细胞内源性和系统性免疫耐受。由此首次提出并验证“纠正肝脏内源性免疫耐受可以逆转全身系统性免疫耐受”这一观点。该双功能载体的治疗策略不仅可以应用于HBV感染治疗,还可以应用于其他病毒感染和肿瘤的治疗。4首次发现并证实PD-L1是miR-200c的一个靶基因。HBV感染可以通过抑制miR-200c的表达进而上调PD-L1的表达水平。而高水平的PD-L1通过与PD-1结合进一步抑制CD8+T细胞的功能,并促进其发生凋亡。1niR-200c过表达可以增强CD8+T细胞的抗HBV的功能,进而降低HBV载量。该研究结论为开发基于miRNA的新型抗HBV免疫治疗性药物提供了重要启示。