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第一部分培养扩增小鼠骨髓源树突状细胞及其生物学鉴定目的:探讨体外扩增小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的方法并进行形态学观察和生物学特性鉴定。方法:用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,倒置显微镜动态观察形态学变化,流式细胞术分析细胞表面分子,同时进行刺激初始型T淋巴细胞增殖能力的检测。结果:体外培养9天后小鼠树突状细胞可达80%以上,光镜下可见典型的树突状细胞形态。未成熟DC的细胞表型为CD11clow、MHCIIlow、CD86low,未成熟DC经LPS刺激培养后可转变为成熟DC,细胞表型为CD11chigh、MHCIIhigh、CD86high ,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论:本方法可获得较高纯度的骨髓树突状细胞,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的高成本,复杂操作,低产出率的弊端,为研究树突状细胞的功能以及运用其开展下游实验提供材料第二部分细胞慢病毒感染及感染后细胞中基因表达状况检测目的:使用已构建成功的小鼠Smad6基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞(BMDC)的Smad6基因表达。方法:运用构建好的慢病毒载体,根据前期试验所明确的感染复数对第一部分所培养的小鼠BMDC进行感染,120h后收集细胞,并经倒置荧光显微镜、RT-PCR,WESTERN BLOT检测Smad6基因的表达状况。结果:荧光显微镜观察初步推断病毒感染效率在75%左右, PCR和WESTERN BLOT证实,通过病毒途径,在BMDC细胞中smad6基因的沉默效约为85%。结论:通过使用慢病毒载体,较成功抑制小鼠BMDC中Smad6基因表达。说明运用慢病毒做RNAi载体可以实现对DC细胞某一基因的有效沉默。第三部分RNAi抑制Smad6并在TGF-β1作用下对小鼠骨髓源树突状细胞生物学特性变化的研究目的:探讨在Smad6基因被抑制并有TGF-β1刺激的情况下,小鼠骨SH髓源树突细胞生物学特性是否存在着变化。方法:分别以GM-CSF和IL-4诱导培养两批小鼠BMDC ,其中一批经用慢病毒感染,对细胞进行Smad6基因抑制,6d后同时用TGF-β1刺激,再经过48h后分别对两批细胞进行电镜观察、流式细胞术检测细胞表型CD11C、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ,混合淋巴细胞反应检测其抗原提呈功能,检测细胞凋亡情况,收集上清液用ELISA检测IL-6,IL-12 p70。结果: Smad6未干扰组电镜下DC成熟样特征较明显,CD11c、CD80、CD86及MHCⅡ的表达水平也较高,细胞凋亡指数较低,混合淋巴细胞反应和分泌IL-4、IL-12 p70能力较强,Smad6干扰组DC形态成熟特征不明显,CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ的表达水平较低,细胞凋亡指数较高,混合淋巴细胞反应和分泌IL-4、IL-12 p70能力较弱。结论:在小鼠BMDC中Smad6基因被抑制并有TGF-β1刺激的情况下,细胞多呈未成熟状态,以未成熟的生物学特性为主,而Smad6基因未被抑制情况下,细胞更接近于成熟状态。