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目的:自发性蛛网膜下腔出血(SAH,subarachnoid hemorrhage)是一种高发病率、高致死致残率的神经危重症,以动脉瘤性SAH居多。以往研究认为脑血管痉挛(CVS,cerebral vasospasm)是SAH后严重并发症之一,是导致高致残致死率的首要原因,也是导致SAH后迟发性缺血性神经功能障碍(DIND,delayed ischemic neurological deficit)主要原因。目前研究则认为,SAH后脑血管自动调节功能失衡是导致DIND、脑肿胀、血管源性脑水肿等的主要原因。血管平滑肌细胞(VSMC,vascular smooth muscle cells)作为血管神经网络的基本结构和功能组成成分,在稳定脑血管紧张性、调节脑血流方面发挥着重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ(PPARβ/δ,peroxisome proliferator activated receptorβ/δ)被证实能调节VSMC增殖,维持血管的稳态。在本研究中,通过构建脑VSMC血红蛋白刺激和大鼠实验性SAH模型,研究PPARβ/δ对脑VSMC表型转化以及对脑血管重塑的影响,并初步探讨其潜在机制,为临床治疗迟发性脑缺血提供新的思路。方法:1.SD大鼠大脑动脉环及基底动脉原代脑VSMC,进行细胞鉴定和传代培养,6代以内的脑VSMC用于后续试验。不同浓度的血红蛋白(Hb,hemoglobin)(1μM、5μM、10μM、15μM、20μM)分别孵育生长状态良好的脑VSMC 24小时。Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb。免疫荧光双标半定量α-SMA和Smemb表达情况。2.1μM GW0742孵育脑VSMC 24小时后,或Ad-PPARβ/δ转染脑VSMC 48小时后,再以10μM Hb刺激GW0742或Ad-PPARβ/δ预处理的脑VSMC 24小时。Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb,以及PPARβ/δ表达情况。免疫荧光双标半定量α-SMA和Smemb表达情况。3.50n Msi-PPARβ/δ或NC-si RNA转染脑VSMC 48小时以后,再以10μM Hb刺激脑VSMC 24小时。Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、Smemb,以及PPARβ/δ表达情况。4.在GW0742或Ad-PPARβ/δ分别预处理脑VSMC 30分钟之前,用1μM PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002处理细胞。再分别用10μM Hb刺激脑VSMC 24小时。Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb,以及p-Akt、Myocardin表达情况。免疫荧光双标检测SRF半定量和核转移情况。5.构建SD大鼠颈内动脉穿刺SAH模型,并通过侧脑室注射Ad-PPARβ/δ或Ad-GFP。使用改良的神经功能行为学Garcia评分和Beam Balance评分检测大鼠神经功能行为学改变。取大脑动脉环和基底动脉提取组织总蛋白,Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、Smemb,以及PPARβ/δ表达情况。免疫荧光双标实验半定量基底动脉α-SMA、Smemb的表达情况,并测量其管壁厚度和血管内径长度。结果:1.不同浓度的Hb(1μM、5μM、10μM、15μM、20μM)分别刺激生长状态良好的脑VSMC 24小时后,Western Blot或荧光免疫双标检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb。随着Hb浓度逐渐增加,α-SMA表达量逐渐下降,Smemb表达量则逐渐升高。当Hb浓度到达10μM时,α-SMA和Smemb表达量的变化达到最高峰。但进一步增加Hb浓度,α-SMA和Smemb表达量则都下降,后续试验以10μM为最佳刺激浓度。同Control组相比,Hb组α-SMA和SM-MHC表达量明显下降,相反OPN和Smemb表达量则明显升高。荧光免疫双标也证实Hb组α-SMA表达量明显下降,Smemb表达量则明显升高。2.1μM GW0742预处理脑VSMC 24h后,或Ad-PPARβ/δ预处理脑VSMC 48h后,再以10μM Hb刺激脑VSMC 24小时。Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb,以及PPARβ/δ表达情况。免疫荧光双标半定量α-SMA和Smemb表达情况。10μM Hb刺激脑VSMC 24小时,Hb组α-SMA和SM-MHC表达量明显下降,相反OPN和Smemb表达量则明显升高,同时PPARβ/δ的表达量也明显下降。但GW0742组或Ad-PPARβ/δ组α-SMA和SM-MHC表达量则明显逆转,出现升高的现象,而OPN和Smemb表达量则出现明显的下降。免疫荧光双标证实GW0742组α-SMA表达升高,Smemb表达量则下降。3.50n M si-PPARβ/δ或NC-si RNA转染脑VSMC 48小时以后,再以10μM Hb刺激脑VSMC 24小时。Western Blot检测VSMC表型转化的标记蛋白α-SMA、Smemb,以及PPARβ/δ表达情况。相比于NC-si RNA组,si-PPARβ/δ组PPARβ/δ表达明显被抑制。虽然si-PPARβ/δ进一步抑制了PPARβ/δ表达量,但α-SMA和Smemb的表达量相比于NC-si RNA组或Hb组无明显变化。4.1μM PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002预处理脑VSMC后,p-Akt表达量明显下降。同时GW0742或Ad-PPARβ/δ抑制Hb诱导的脑VSMC表型转化的作用明显被抑制,相较于无LY294002预处理组α-SMA和SM-MHC表达量明显下降,而OPN和Smemb表达量则明显上升。同时,LY294002预处理组Myocardin表达量也明显下降。免疫荧光双标实验,Ad-PPARβ/δ明显促进SRF向核内转移,而LY294002预处理后则明显抑制了SRF的核转移。5.随着SAH造模后时间逐渐增加,α-SMA表达量逐渐降低,而Smemb表达量则逐渐上升。但是第3天和第5天表达量则无明显差异,后续实验则以3天为观测时间。SAH后3天PPARβ/δ表达明显下降,同时α-SMA表达量也下降。但Ad-PPARβ/δ组,PPARβ/δ表达明显上升,同时上调α-SMA的表达,抑制Smemb的表达。基底动脉免疫荧光实验证实,同SAH组或Ad-GFP组相比,Ad-PPARβ/δ组,基底动脉管壁厚度明显降低,而血管内径则明显增加。改良的神经功能行为学Garcia评分和Beam Balance神经行为学评分证实,Ad-PPARβ/δ能明显改善SD大鼠SAH后神经功能的缺失,促进神经功能的恢复。结论:1.Hb能明显促进体外原代培养的脑VSMC由收缩型向合成分泌型转换,使收缩型标记蛋白α-SMA、SM-MHC表达量明显下降,而合成分泌型标记蛋白OPN和Smemb表达量明显上升。2.PPARβ/δ能明显抑制Hb诱导的脑VSMC表型转化,使收缩型标记蛋白α-SMA、SM-MHC表达量明显上升,同时抑制合成分泌型标记蛋白OPN和Smemb的表达。3.PPARβ/δ通过激活PI3K/AKT信号通路,促进p-Akt、Myocardin表达和SRF核转移,来发挥稳定脑VSMC表型的作用。4.PPARβ/δ明显抑制实验性SD大鼠SAH后脑VSMC表型转化,同时改善基底动脉病理性血管重塑:降低血管管壁厚度;增加血管内径长度,并促进SD大鼠神经功能学的恢复。