共生固氮可为豆科植物提供所需氮量的30％～50％，人工接种根瘤菌剂，可增加土壤氮素含量，减少化肥的使用，提高鲜草产量或固氮量;但土著根瘤菌会限制根瘤菌剂的根际定殖和结瘤能力，导致接种菌剂达不到预期的结瘤固氮效果，筛选一株竞争能力高的优良菌株可解决该问题。共生固氮过程需要高度协调的信号交流，受到宿主和根瘤菌双方的共同调节和控制，研究该过程中根瘤菌体内诱导表达的基因，有助于了解根瘤发育过程中的基因表达调控系统，为提高结瘤固氮效率提供新的思路。　　 近年来，竞争结瘤受到广泛关注，对根瘤菌竞争结瘤有关的基因和豆科植物寄主特异性结瘤的基因均有了一定的认识。本文拟通过竞争结瘤实验研究华癸根瘤菌不同菌株间的竞争结瘤能力:以紫云英宁波大桥品系作为宿主植物，因苗期15天时，菌株Z8、Z9、Z10尚未结瘤，故选择15天就可同宁波大桥结瘤的华癸根瘤菌7653R与另外7株取自于浙江不同地区不同土质的华癸根瘤菌Z1～Z7为研究对象，以接种无菌水的处理为空白对照，分别调节8株根瘤菌的菌悬液浓度为106 CFU/mL、107 CFU/mL，通过单独接种、1∶1混合接种7653R和Z1～Z7，在30天时采样，统计根瘤数量、根瘤重量、不同菌株的占瘤率、定殖能力，研究菌株7653R与另外7株根瘤菌之间的竞争结瘤能力，结果发现7653R和Z2～Z7的竞争结瘤能力相当，均远大于Z1的竞争结瘤能力;在多数同时含有两种根瘤菌的根瘤内，7653R和Z2～Z7的定殖能力相近。　　 根瘤菌在结瘤固氮过程中的体内诱导表达基因，具有重要的生理作用，可能会影响结瘤固氮效率和竞争结瘤。本文拟以R.etli CFN42、M.loti NZP2213的Sm突变株ZN1、ZN0为供试菌株，尝试建立根瘤菌体内诱导表达基因的筛选体系。　　 初期，尝试建立基于抗性标签的体内表达技术的筛选体系。以pJZ260（转座子上含有无启动子的Km抗性基因）为出发质粒，构建了pZNN121（将转座子上的Km抗性基因替换成Gen抗性基因），分别通过体外和体内条件下Km、Gen对ZN1、ZN0及其转座子插入突变子的杀菌率实验，考察Km、Gen作为抗性标签的可行性。在体外条件下，终浓度500μg/mL的Km处理ZN1、ZN02h，杀菌率分别为97％、78％;终浓度75μg/mL的Gen处理ZN12h，杀菌率为99.9％，终浓度25μg/mL的Gen处理ZN01h，杀菌率可达99.9％，初步说明Gen抗性标签具有可行性。在体内条件下，Gen对ZN1的杀菌率不稳定，有时甚至降至70％以下，终浓度100μg/mL的Gen处理 ZN02h，杀菌率可达99.9％，且重复性良好，初步确定以ZN0为供试菌株。　　 通过二亲接合建立插入Gen抗性标签的突变子文库ZK，以Gen抗性基因反向插入启动子方向，且插入位点各异的5个突变子(ZK1、ZK2、ZK3、ZK4、ZK5)为阴性对照。体外条件下的杀菌率实验发现，ZK1、ZK2、ZK3、ZK4、ZK5分别经终浓度100μg/mL、200μg/mL、500μ g/mL的Gen处理2h后，菌体平均存活率分别为33.49％、23.74％、18.76％，说明即使Gen抗性基因方向与被插入基因的表达方向相反，突变子ZK仍具有一定的Gen抗性，这在筛选过程中势必会产生大量的假阳性，对筛选极为不利，该筛选策略不可行。　　 同时研究了基于流式细胞术的体内诱导表达基因筛选体系。以ZN1、ZN0为供试菌株，利用含有gfp-lacZ报告基因的转座子随机插入的方式建立了突变子文库FK、NK，分别挑选FK、NK中的蓝白斑，检测β-半乳糖苷酶活性和绿色荧光蛋白表达强度，发现二者的β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白表达是同步的，但是报告基因在ZN1中的表达量过低，这可能与基因表达的遗传背景不同有关，故选择ZN0为供试菌株。　　 分别以蓝斑NK1和白斑NK5作为阳性对照和阴性对照，二者绿色荧光蛋白表达量约相差10倍，通过Arbitrary PCR及测序得知NK1、NK5基因组上转座子插入的方向分别与启动子同向、反向;设定门=101，调节菌悬液浓度约106 CFU/mL作为待分选的细胞悬液，可分选出GFP表达量高的目标菌株，分选得率约98％。此外，确定了制备新鲜细胞悬液的条件:采用研磨处理捣碎根瘤，利用50％ PEG6000差速离心将菌体和瘤体组织分离，该过程可回收75％的菌体，PBS清洗并调节菌悬液浓度约106 CFU/mL，作为待分选的细胞悬液;以脱离瘤体组织2h内菌体作为体内条件下的样本，利用分选式流式细胞仪进行分选，将分选出的菌株涂布在TY（Sm Km X-Gal）的平板上，待长出单菌落，白斑即目标菌株。至此，建立了基于流式细胞术的M.lotiNZP2213体内诱导表达基因筛选体系。　　 本文研究了7653R和其它7株华癸根瘤菌之间的竞争结瘤能力，7653R和Z2～Z7竞争结瘤能力相当，远大于Z1;在多数同时含有两种菌的根瘤内，7653R和Z1～Z7定殖能力相近。本文否定了基于Km、Gen抗性标签的体内表达技术的筛选体系，建立了基于流式细胞术的M.loti NZP2213体内诱导表达基因筛选体系。