心肌肥厚是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应。初期的心肌肥厚有一定的代偿意义,但持续性心肌肥厚最终可导致心力衰竭和猝死。因此,研究心肌肥厚的分子机制具有极其重要的意义。越来越多的研究表明ox-LDL与心肌重构和心脏功能有关。众所周知,ox-LDL是致动脉粥样硬化的关键步骤。ox-LDL能促进SMC增殖。然而,心肌细胞对刺激不能产生增殖反应,主要表现为肥厚。因此,ox-LDL除了有致动脉粥样硬化作用,还可能诱导心肌肥厚。最近的研究表明ox-LDL影响了心脏的结构和功能,该作用与传统的危险因子：如生活方式、炎症等无关。临床研究也表明ox-LDL是早期心室重构的危险因子,另外有研究发现他汀类药物有减轻血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞肥厚作用。许多研究表明,ox-LDL和血管紧张素Ⅱ及AT1之间有密切联系。有研究发现,ox-LDL增加人冠状动脉内皮细胞ATl的表达；而血管紧张素Ⅱ作为一个重要的致心脏重塑及动脉粥样硬化因子,它可通过激活AT1增加人冠状动脉内皮细胞LOX-1的表达。LOX-1是作为ox-LDL特异性受体的一种Ⅱ型膜蛋白,它在ox-LDL引起动脉粥样硬化及其他心血管疾病中起重要作用,ox-LDL能显著增加兔主动脉LOX-1的表达,给予氯沙坦显著减少LOX-1的表达。以上的研究表明LOX-1与ATl的相互作用可能与ox-LDL引起的心脏重塑有关。尽管正常心肌细胞表达LOX-1很少,但在心力衰竭的心脏,LOX-1的表达显著上调。目前很少有研究关注LOX-1在心肌肥厚中的作用。本研究将观察ox-LDL是否引起心肌肥厚及LOX-1和AT1在此过程中的作用。第一部分ox-LDL诱导小鼠心肌肥厚模型的建立尽管ox-LDL是动脉粥样硬化的危险因子,但最近的临床研究表明ox-LDL参与心肌损伤,包括心力衰竭和心肌肥厚。我们推测ox-LDL可能诱导心肌肥厚。我们首先研究ox-LDL与心肌肥厚的关系。利用8周龄野生型雄性小鼠(WT,C57BL/6)和ApoE基因敲除雄性小鼠(ApoE-/-)建立TAC模型,给予普通饮食或高脂饮食。2周后,高脂饮食的ApoE-/-小鼠血清ox-LDL浓度显著高于普通饮食的ApoE-/-小鼠。然而,高脂饮食不影响WT小鼠血清ox-LDL浓度。在TAC2周后,心肌肥厚的指标如左心室壁厚度、心脏大小、心重／体重、心肌细胞横截面积均明显增高,心室容积却下降,心功能无影响。TAC的ApoE-/-小鼠在普通饮食或高脂饮食2周后,随着血清ox-LDL浓度的升高,心肌肥厚也逐渐加重。有趣的是：ApoE-/-小鼠在高脂饮食2周后虽然没有进行TAC也发生了心肌肥厚,并且TAC引起ApoE-/-小鼠高脂饮食的心肌肥厚程度大于ApoE-/-小鼠普通饮食+TAC的心肌肥厚。然而,WT小鼠不管是高脂饮食还是普通饮食在TAC后心肌肥厚程度相似。我们在实验中应用的ApoE-/-小鼠和WT小鼠未发现明显的主动脉、冠状动脉粥样硬化斑块。我们也在WT小鼠应用微泵给予ox-LDL观察到ox-LDL诱导WT小鼠心肌肥厚。上述结果证实了ox-LDL诱导小鼠心肌肥厚,ox-LDL加重TAC引起的心肌肥厚。第二部分ox-LDL诱导心肌细胞肥大模型的建立我们已经证实在体情况下ox-LDL诱导心肌肥厚。因此,我们进一步研究在离体情况下ox-LDL是否也诱导心肌细胞肥大。首先,培养新生大鼠心肌细胞后给予ox-LDL (50μg/ml)刺激,ox-LDL引起心肌细胞3H-亮氨酸掺入法测定的心肌细胞蛋白质合成速率明显增加,说明ox-LDL刺激心肌细胞蛋白合成增加。其次,我们应用a-MHC免疫荧光染色心肌细胞后观察心肌细胞表面积,结果显示：ox-LDL刺激心肌细胞引起细胞表面积明显增大。另外,p-ERK和一些肥厚基因ANP、SAA也是心肌细胞肥厚的重要反应。我们用ox-LDL刺激心肌细胞不仅引起p-ERK蛋白增多,还导致ANP、SAA mRNA表达升高,以上结果说明ox-LDL诱导离体心肌细胞肥厚。第三部分ox-LDL诱导心肌肥厚与AT1和LOX-1受体有关我们已经证实无论是在体还是离体时ox-LDL均可诱导心肌肥厚,而LOX-1是ox-LDL的特异性受体。因此,我们通过应用LOX-1中和抗体来观察LOX-1在ox-LDL诱导心肌肥厚中的作用。在培养的心肌细胞,预先给予LOX-1中和抗体完全抑制了ox-LDL诱导的心肌细胞表面积增大、p-ERK和肥厚基因ANP、SAA的表达。同样ApoE-/-小鼠给予LOX-1中和抗体也完全抑制了高脂饮食引起ox-LDL升高而诱导的心肌细胞横截面积增大、p-ERK和肥厚基因ANP、SAA的表达。以上结果表明：ox-LDL通过LOX-1诱导心肌肥厚。研究认为RAS参与LOX-1引起的动脉粥样硬化过程,因此我们进一步研究Angll和AT1在ox-LDL诱导心肌肥厚中的作用。我们利用AT1阻断剂氯沙坦和血管紧张素转化酶抑制剂依那普利进行预处理心肌细胞和ApoE-/-小鼠,结果显示氯沙坦与LOX-1中和抗体一样能完全抑制ox-LDL诱导的心肌肥厚。然而,依那普利仅能部分抑制ox-LDL诱导的心肌肥厚,其作用不如氯沙坦。无论是氯沙坦还是依那普利均对ApoE-/-小鼠血压、心功能和血清ox-LDL无影响,因此我们认为ox-LDL/LOX-1也作用于AT1,并且不完全依赖血管紧张素Ⅱ。上述结果证实了ox-LDL诱导的心肌肥厚与AT1和LOX-1受体有关第四部分ox-LDL通过LOX-1和AT1受体直接结合诱导心肌肥厚我们以上的实验已经发现LOX-1和AT1-R在心肌肥厚中可能存在相互作用。因此,我们进一步研究LOX-1和AT1-R的关系。免疫印迹和PReal Ttime PCR结果显示：无论在蛋白水平,还是在mRNA水平,LOX-1和AT1在ApoE-/-小鼠高脂饮食后表达明显增高。同样,在体外培养的心肌细胞给予ox-LDL刺激也引起LOX-1和AT1升高。给予LOX-1中和抗体或氯沙坦显著逆转ox-LDL刺激引起的LOX-1和AT1升高,但是依那普利仅部分逆转ox-LDL刺激引起的LOX-1和AT1升高。免疫荧光结果显示LOX-1(红色)和AT1(绿色)在ox-LDL刺激的心肌细胞荧光增强位于细胞膜,同样给予LOX-1中和抗体或氯沙坦预处理,LOX-1(红色)和AT1(绿色)的荧光明显减弱。我们开始关注在ox-LDL诱导心肌肥厚中LOX-1和AT1的相互作用。它们是如何作用的?是直接作用还是间接作用?为了解决以上的问题,我们首先应用了免疫共沉淀技术进行以下的实验。结果显示无论是心肌细胞还是ApoE-/-小鼠的心肌组织均存在ox-LDL刺激引起LOX-1和AT1结合,并且明显高于对照组。给予LOX-1中和抗体或氯沙坦几乎完全逆转该现象。而依那普利无明显的逆转该现象的作用。以上的结果说明ox-LDL刺激引起LOX-1和AT1结合。我们进一步观察了LOX-1和AT1是否直接结合。为了解决以上的问题,我们应用了双分子荧光互补技术进行以下的实验。我们构建了以下的质粒：AT1/KGC:GFP的C端连接到AT1的C端；AT1/KGN:GFP的N端连接到AT1的C端；LOX-1/KGN:GFP的N端连接到LOX-1的N端；LOX-1/KGC:GFP的C端连接到LOX-1的N端；由于只有GFP的N端和C端结合才能发绿色荧光,我们将AT1/KGN和LOX-1/KGC或AT1/KGC和ILOX-1/KGN共转染入COS7细胞,然后给予ox-LDL刺激。结果显示无论是共转染AT1/KGN和ILOX-1/KGC还是共转染AT1/KGC和LOX-1/KGN给予ox-LDL刺激均发现COS7细胞发绿色荧光。由此说明ox-LDL刺激引起LOX-1和AT1直接结合。我们认为LOX-1和AT1相互作用不依赖于血管紧张素Ⅱ,我们再次应用不含血管紧张素原及AT1的COS7细胞进行一些实验,转染LOX-1和AT1质粒进入COS7细胞后给予ox-LDL刺激观察p-ERK的表达。在未转染的细胞给予ox-LDL刺激不能引起p-ERK的表达增加,而在单独转染LOX-1或AT1质粒后给予ox-LDL刺激也不能引起p-ERK的表达增加,只有在共同转染LOX-1和AT1质粒后给予ox-LDL刺激才能引起p-ERK的表达增加。我们进一步观察了AT1与LOX-1的作用位点,我们构建了AT1的3个突变质粒：K199Q、Q257A、C289A,分别与LOX-1共同转染COS7细胞后给予ox-LDL刺激,观察p-ERK的表达。结果显示Q257A的AT1质粒与LOX-1共同转染COS7细胞后给予ox-LDL刺激不能引起p-ERK的表达增加,而K199Q、C289A与LOX-1共同转染COS7细胞后给予ox-LDL刺激却能引起p-ERK的表达增加。以上结果显明：AT1的Q257A位点在LOX1和AT1-R的相互作用中起着重要的作用。结论1.在体、离体ox-LDL均可诱导心肌肥厚。2. ox-LDL诱导的心肌肥厚与LOX-1、AT1直接结合有关。3. ox-LDL诱导的心肌肥厚可以被LOX-1中和抗体、AT1阻断剂氯沙坦完全逆转,而ACE抑制剂依那普利只能部分抑制ox-LDL诱导的心肌肥厚。潜在应用价值1.本研究建立的ox-LDL诱导心肌肥厚模型进一步丰富和完善了心肌肥厚细胞模型和动物模型系统,为心肌肥厚机理的研究和实验性干预治疗提供了理想的实验研究平台。2.本研究发现LOX-1与AT1受体在ox-LDL诱导心肌肥厚中起重要作用,发展LOX-1阻断剂为心肌肥厚的治疗提供了新的靶点。创新点1.建立了ox-LDL诱导心肌肥厚模型。2. ox-LDL诱导的心肌肥厚与LOX-1、AT直接结合有关。