研究背景及目的房室结（atrioventricular node，AVN）是位于右心房和心室之间高度特化的传导组织，是唯一连接心房和心室之间的传导通道，也是兴奋由心房进入心室的唯一电信号通道。它的重要功能是保证心房和心室在不同的时间内有序的收缩。房室结的传导速度很慢，其中，以结区的传导速度为最慢。这一慢的传导将导致心房和心室之间的收缩延迟，以保证心室不会与心房发生同步收缩。在某些病理情况下，房室结具有进一步的功能，例如，窦房结起搏点或心房传导障碍，房室结将以它固有的自律性成为心室工作的起搏点。尽管，已知房室结的重要功能和意义，但对其电生理机理仍不明确。已有研究表明某些离子通道及离子通道基因表达在心肌细胞，包括自律细胞，例如，心脏起搏组织窦房结和房室结存在小电导-Ca²⁺-激活K⁺通道（small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel）。SK通道是K⁺选择性，非电压依赖性，唯一通过细胞内Ca²⁺激活的一种钾通道。在哺乳动物脑内，SK通道主要有3种亚型：SK1、SK2和SK3通道，它们对蜂毒明肽（apamin）-SK通道的阻断剂的敏感性不同，其中，SK2通道对apamin最敏感，其次是SK3通道，SK1对apamin的敏感性较低。迄今为止，已编码至少3个明确的SK通道基因，即KCNN1（SK1）、KCNN2（SK2）和KCNN3（SK3）。SK通道广泛存在于机体不同的组织，包括脑、周围神经、肝脏和平滑肌。SK通道在心脏表达的功能意义，鲜为人知。Dr．Chiamvimonvat实验室近来证明人和小鼠心肌细胞存在SK2通道，明显参与动作电位的复极化过程，且在心房的表达明显高于心室。进一步研究发现，过表达SK2通道的小鼠易发生心律失常，并伴有明显的房室结功能及房-室传导异常。本研究采用SK2通道过表达小鼠和SK2通道敲除小鼠，分别检测了它们对房室结功能的影响，首次证明了SK2通道在房室结的重要功能意义。通过建立HEK（Human embryonic kidney）293细胞SK2通道表达细胞株，探讨了SK2通道的调节及其与α-actinin2（肌动蛋白细胞骨架的结合蛋白）相互作用的分子机理。方法1．本研究采用16-22w，体重20-25g，具有C5781／6J背景的SK2通道过表达小鼠（SK2+／T），SK2通道敲除小鼠（SK2+／A，SK2A／A）及SK2野生型小鼠（Wild-type，WT），雌雄不拒。2．动物心电图（Electrocardiogram，ECG）记录：上述3组动物，腹腔注射苯巴比妥钠麻醉（60mg／kg），37℃条件下行肢体导联记录。3．AVN自发性动作电位（action potential，AP）记录：动物麻醉同上，取出心脏，暴露右心房，分离房室结区。采用3mol／L KCl微电极细胞内记录SK2+／T、SK2+／△及WT组房室结自发性AP。4．AVN细胞分离及全细胞IK，ca的记录：WT、SK2+／T and SK2+／△小鼠AVN单个细胞的分离参照以往的方法并进行改良。单个AVN细胞Ca²⁺激活K⁺电流(Ca²⁺-activited K⁺ current，IK，ca)的记录采用全细胞膜片钳法，钳制电压为-55mV，给予阶梯去极化脉冲刺激从-90mV～+40mV，滤波2KHz，采样频率10KHz。记录给予apamin（500pmol／L）前后的IK，ca，室温下进行。Apamin-敏感K⁺电流的计算为apamin（500pmol／L）给药前后Ik，ca电流密度的差（值）。5．双重免疫组化荧光标记：取WT和SK2△／△小鼠新鲜分离的心肌细胞，4％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白封闭，加入一抗，4℃过夜。双重免疫组化荧光标记分为2组①抗SK2抗体（1∶100稀释）+α-actinin2抗体（1∶800）；②抗SK2抗体（1∶100）+抗NF 160KD（neurofilament 160 KD，NF160 KD）抗体（1∶100）。二抗为FITC-羊抗兔IgG（1∶250）和TEXRED-羊抗鼠IgG（1∶250）。以二抗作为阴性对照，同时进行。6．免疫组织化学：制备WT及SK2基因敲除小鼠（SK2A／A）心脏石蜡系列切片，各取WT及SK2△／△相邻心脏切片，5％羊血清封闭，抗SK2抗体（1∶200）与切片孵育，4℃过夜，再与生物素标记的二抗反应。7．建立SK2通道表达的HEK293细胞株：HEK293细胞株在Dulbecco’s modified Eagle’s培养液常规条件下培养并传代（37℃in an air／5％CO2）。参照Lipofectamine^{T M}2000试剂盒说明书，下列质粒分别转染入HEK293细胞：1)pSK2-IRES-EGFP&pcDNA3-α-actinin2；2)pSK2-IRES-EGFP。8．膜片钳记录：转染后36～48 hrs的HEK293细胞在室温条件下行全细胞膜片钳Ik，ca记录。记录前4hrs，将已转染SK2+和α-actinin2质粒的细胞给予Cytochalasin D（CyD，2.5μmol／L）。Ik，ca记录程序和条件同上述AVN细胞。9．HEK293细胞SK2和α-actinin2蛋白的表达：Western blot检测共转染α-actinin2和SK2的HEK293细胞α-actinin2和SK2蛋白的表达。10．免疫组化荧光标记：将共转染SK2+α-actinin2质粒后2-3 day的细胞2％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白封闭，加入抗SK2抗体（1∶100）+抗α-actinin2抗体（1∶800），4℃过夜。二抗为FITC-羊抗兔IgG（1∶250）和TEXRED-羊抗鼠IgG（1∶250）。结果1．SK2+／T和SK2+／△小鼠显示窦房结和AVN功能异常：心电图的记录表明SK2+／△小鼠与WT比较，P-R间期明显延长，并伴有窦性心动过缓。相反，SK2+／T小鼠R-R间期及P-R间期明显缩短。提示过表达SK2基因和SK2基因敲除小鼠存在窦房结和房室结起搏功能和房-室传导功能的明显异常。2．SK2+／T小鼠AVN着火率增加，相反的结果见SK2+／△小鼠：分离的AVN自发性AP具有慢的4期自动去极化，且除极速率慢，无明显超射。这些特征表明其自发性AP来自AVN。与WT比较，SK2+／T组AVN自发性AP的频率增加，而SK2+／△小鼠AVN着火频率明显减小。详细分析自发性AP发现其周期长度（cycle-length，CL）、动作电位持续时间（action potential duration，APD）及舒张期自动去极化速度（the rate of diastolic depolarization，DDR）有明显变化。与WT比较，过表达SK2通道引起AP复极达80％（APD80）的时间缩短，DDR增快及相应的CL缩短。相反的结果见于SK2通道缺失小鼠。结果表明，SK2通道表达异常可明显影响AVN细胞自发性着火频率，进而影响心脏房-室传导。3．单个AVN细胞IK，Ca的变化：电流密度-电压关系曲线证明这一电流具有内向整流的特征，通道电流的大小随电压升高而减低，亦与时间无关，其电流的外向及内向成份都可被apamin所阻断。反转电位约-80 mV，符合Nernst方程。SK2+／T小鼠，其AVN细胞apamin敏感K⁺电流明显大于WT；而SK2通道敲除小鼠，其apamin敏感K⁺电流明显小于WT。结果表明房室结细胞存在apamin敏感的Ik，ca。推测其Ik，ca的变化是AVN细胞自发性AP改变的直接原因。4．激光共聚焦显微镜：单个AVN细胞具有对特异性SK2抗体的免疫阳性反应。心房和心室细胞也具有SK2蛋白的阳性信号。NF160作为心脏起搏组织和传导系统的标志，其阳性反应仅见于AVN细胞，以区别心室或心房细胞。5．AVN SK2免疫阳性反应：心脏组织切片AVN，心房及室间隔均可见SK2蛋白阳性反应（棕色）。与WT比较，无明显阳性反应呈现于SK2△／△小鼠心肌组织，包括AVN。结果表明SK2免疫阳性反应存在于房室结。采用H&E和Trichrome染色进一步鉴定了AVN的解剖部位。6．α-actinin2对HEK293细胞Ik，ca的调节：共表达α-actinin2和SK2细胞的IK，ca电流密度明显大于仅表达SK2细胞的电流密度，Ik，ca电流密度增加了4倍。未转染的细胞，无明显IK，ca电流。Cytochalasin D预处理共表达α-actinin2和SK2通道的细胞，以阻断细胞骨架蛋白与SK2通道的相互作用，Ik，ca电流密度明显减小。7．SK2通道的表达及其与α--actinin2的共定位：Western blot检测共表达α--actinin2和SK2的HEK293细胞，其α--actinin2分子量约98 kDa。SK2蛋白表达为单聚体和二聚体，两个带分别约为60 and120 kDa。结果与期望值一致。激光共聚焦显微镜显示共表达SK2通道α-actinin2蛋白的HEK293细胞对SK2和α-actinin2抗体均具有免疫阳性反应，且SK2通道与α--actinin2共定位于HEK293细胞的细胞膜。结果提示SK2通道与α-actinin2分子的相互作用。讨论有关房室结电生理方面的动物研究见于家兔，偶见一例有关小鼠房室结电生理研究的报道。其原因在于房室结解剖部位的特点，房室结位于心房和室间隔之间，部位较深。此外，房室结细胞细小，且房室结的致密结区与周围结区之间包绕着结缔组织。由于这些特征，为电生理记录、免疫荧光染色、Western Blot等检测方法的应用带来了困难和限制，尤其是小动物。本研究成功建立了小鼠房室结制备和单个房室结细胞分离和鉴定方法，为从事小鼠靶基因模型，尤其是起搏功能异常的小动物研究奠定了基础。本研究采用两种靶基因模型，即过表达SK2和SK2通道敲除小鼠，使我们能够从整体水平、分离的房室结及单个细胞对SK2通道功能进行检测和比较。过表达SK2通道导致AVN细胞动作电位复极化加快，伴有AVN自发性电活动增加；而敲除SK2通道导致相反的AVN电活动变化。详细分析其变化，发现过表达SK2通道引起AVN着火率增加伴有增快的DDR和明显缩短的APD80。SK2通道敲除则引起AVN自发性电活动明显减慢，伴有明显延长的APD80和慢的DDR。为进一步证明SK2+／T和SK2+／△小鼠AVN功能的变化确实是由于SK2通道表达异常所致，本研究采用与记录心肌工作细胞相同的全细胞膜片钳程序，直接检测了AVN细胞IK，ca的变化。钳制电压-55mv使绝大部分存在于AVN细胞的一过性外向K⁺电流和T-型Ca²⁺通道失活，细胞外液无Na⁺和Ca²⁺，并用已知的细胞内Ca²⁺浓度激活SK2通道。在此条件下，可记录到与心肌工作细胞相近似的内向整流K⁺电流，并可被apamin所阻断。结果也表明过表达SK2通道，房室结细胞apamin-敏感K⁺电流明显增大，而敲除SK2通道，apamin-敏感K⁺电流几乎消失。SK2+／△小鼠AVN APD80明显延长可能与AVN细胞IK，ca下调有关，而SK2+／T小鼠AVN APD80缩短则可能与AVN细胞IK，ca上调有关。为研究SK2+／T小鼠和SK2+／△小鼠AVN功能异常是否与其SK2通道的表达相一致，采用免疫组织化学和激光共聚焦显微镜检测了房室结细胞SK2蛋白的表达。免疫组织化学证实房室结具有SK2免疫阳性反应。激光共聚焦显微成像表明房室结细胞对SK2抗体具有特异性的免疫反应，并表达于细胞膜。心房和心室细胞SK2亚单位表达于T管膜，因为心肌工作细胞存在T管系统（由细胞膜向细胞内凹陷而形成）与心肌兴奋-收缩耦联有关。微肌动蛋白（actinin）是肌动蛋白细胞骨架的结合蛋白。研究表明它可以连接细胞骨架蛋白与膜蛋白，例如膜离子通道。膜离子通道是高度特化的膜蛋白，其在细胞膜上的亚细胞定位是决定该通道功能的关键。肌型微肌动蛋白异构体α-actinin2可与一些膜离子通道结合并调节通道的功能，例如，调节电压-门控K⁺通道Kv1.5、NMDA受体、L-型Ca²⁺通道（Cav1.2）、Na⁺通道等。为进一步探讨SK2通道的作用机理，Chiamvimonvat实验室研究了SK2通道α-亚单位与其它蛋白的相互作用。酵母双杂交从人心脏的cDNA文库筛选并证明SK2通道C-末端有两个与α-actinin2的结合位点。体外生物化学、激光共聚焦显微镜也证明SK2通道与α-actinin2蛋白的相互作用及部分共定位。本研究表明SK2亚单位与α-actinin2共定位于HEK293细胞膜。α-actinin2可明显增加共表达SK2和α-actinin2细胞的Ca²⁺-激活K⁺电流。以往的研究表明L-型Ca²⁺通道与细胞骨架蛋白α-actinin2共定位，敲除Cav1.3通道可导致小鼠心肌细胞SK2通道下调。提示小鼠心房细胞SK2通道的功能取决于Cav1.3通道的正常表达，Cav1.3通道与SK2通道的共定位可能与α-actinin2-细胞骨架蛋白的相互作用有关。α-actinin2调节SK2通道可能通过不同的分子机理，一种可能机理即与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）相关。α-actinin2和SK2通道C-末端都含有CaM结合区，且CaM是所有Ca²⁺-激活K⁺通道的感受器。已有研究表明CaM可与α-actinin2竞争与离子通道-NMDA受体结合，从而影响该通道的失活和在膜上的表达。已有报道细胞松弛素Cytochalasin D可直接影响微肌动蛋白与肌动蛋白细胞骨架的相互作用，加速心脏ATP-敏感的K⁺通道下调。本研究发现CyD可干扰共表达SK2和α-actinin2细胞的SK2通道功能。推测细胞骨架网络可能发挥某种作用将SK2通道与肌动蛋白细胞骨架连接并锚定在细胞膜。此外，还可直接或间接的调节通道的功能。本研究提出了一种新的途径研究并理解调节SK2通道的分子机理。SK通道的功能已被证明在于控制神经元的着火率。动作电位的触发，将引起细胞内Ca²⁺增加，进而激活SK能道，产生一持续时间较长的后超极化，后超极化的重要意义在于限制神经元的着火率和重复着火频率，保护细胞避免持续性和强直性兴奋。与SK通道在神经元的作用相比较，SK通道对心肌细胞的影响在于构成动作电位复极化的末期，此期相当于心脏兴奋性周期的相对不应期和超常期，临床上早搏或室上性心律失常常见这一时期。本研究证明心脏过表达SK2通道增加起搏细胞的着火率。推测当运动或交感神经反应性增高等生理情况下，SK2通道可增加房-室传导；而在病理情况下，过表达SK2通道，细胞内Ca²⁺增加也将明显影响房-室传导，例如，过表达SK2通道引起心房纤颤，其心房细胞上调IK，ca，引起快速复极化，加快房-室传导。因而，SK2通道在房性心律失常情况下对房-室传导有重要的调节作用。综上所述，本文首次证明了SK2通道过表达和SK2通道敲除小鼠存在明显的房室结功能异常。心脏SK2通道过表达可增加AVN细胞的自动着火率。而敲除心脏SK2通道则引起心动过缓，房-室传导减慢。心脏SK2通道过表达由于IK，ca上调，增加AP舒张期自动去极化和复极化速度。相反，敲除心脏SK2通道使IK，ca下调，进而减慢AP舒张期自动去极化和复极化速度。此外，本研究采用激光共聚焦显微镜，细胞生物学及电生理技术首次证明SK2通道与α-actinin2的分子相关。α-actinin2与SK2亚单位共定位于细胞膜，并调节SK2通道的功能。