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昆虫是生物中种类数量最为庞大的类群。相较于其它高等动物,昆虫虽然身体相对较小,但繁殖能力强,而且胚胎发育更为简单,时序也相对较短。在昆虫的胚胎发育过程中,涉及了羊膜、浆膜、卵黄囊这三种重要的胚胎外膜的形成、移动、退化。不同的昆虫中胚胎外膜的区别是很大的。研究发现几乎所有的昆虫在胚带形成后都会形成一个浆膜。在胚胎发育早期,由浆膜细胞分泌的附着于卵壳内侧的浆膜表皮,加强了卵壳对胚胎的保护作用,尤其是大大提高了卵的抗干燥能力。在大多数昆虫中,到了胚胎发育后期,还会形成胚胎表皮,但在不同的昆虫中,胚胎表皮的形成次数是有区别的。目前对于昆虫浆膜表皮组分和相关基因研究很少。褐飞虱(Nilaparvata lugens),隶属于半翅目,飞虱科,是水稻上的一种重要害虫,由于其繁殖能力强,极易暴发成灾。但褐飞虱是不是存在浆膜表皮和胚胎表皮还不清楚,对于浆膜表皮组分编码基因更是一无所知。本研究首先对褐飞虱胚胎发育过程中浆膜表皮和胚胎表皮形成进行了观测,然后通过卵壳蛋白质谱(UPLC-MS/MS)测定,转录组和表达谱数据分析,实时荧光定量PCR(RT-qPCR),双链RNA干扰(RNAi),透射电镜(TEM)观察,蛋白免疫印迹(Western blotting)等技术手段,对褐飞虱的浆膜表皮相关蛋白进行了研究,此外还新鉴定了褐飞虱正常表皮形成所需的2种表皮相关蛋白。主要结果如下:1.胚胎期皮层的观察。通过对不同时期卵的TEM观察,发现褐飞虱在胚胎发育的早期会形成浆膜表皮,并在胚胎发育后期部分降解,同时观察到了褐飞虱在胚胎发育的后期会形成一次胚胎表皮。浆膜表皮和胚胎表皮都含有几丁质,形成片层结构。2.浆膜表皮相关蛋白及其编码基因的鉴定和功能研究。我们收集了产下72h卵的卵壳蛋白样品,使用UPLC-MS/MS分析了该样品的蛋白成分,与产下Oh卵的卵壳和若虫孵出后留下的卵壳的蛋白质谱结果进行比较,共获得了 47个蛋白同时存在于72h卵壳和若虫孵出后留下的卵壳的蛋白样品中但不存在于0h的卵壳蛋白样品中,其中共有25个蛋白可信度较高。结合表达谱数据,我们从这25个蛋白的编码基因中选取了 13个在卵期0-72h特异性表达或高表达的基因,推测这些蛋白很可能是浆膜表皮相关蛋白。其中有3个蛋白都是属于CPR家族的表皮结构蛋白(NlugCpr3和NlugCpr2实验室已有报道;NlugCpr97是新发现的蛋白)。我们首先针对余下的10个蛋白编码基因进行了功能分析。我们对这10个基因暂时命名为Nlscrp110。研究发现有3个基因(Nlscrp2,Nlscrp4,Nlscrp5)对浆膜表皮正常形成是必需的,有5个基因(Nlscrp2,Nlscrp4,Nlscrp5,Nlscrp7,Nlscrp10)被干扰后影响了卵的孵化率。3.浆膜表皮中的6种几丁质结合蛋白分析。通过表达谱分析,发现有6个属于CPR家族的表皮蛋白,在胚胎发育的早期大量或特异表达,其中有3个蛋白(NlugCpr2和NlugCpr3,NlugCpr97)在上述浆膜表皮质谱分析主也被检测到。实验室已有研究表明对其中5个基因(NlugCpr1,NlugCpr2,NlugCpr3,NlugCpr8,NlugCpr90)单独进行RNAi,除了NlugCpr2外,其他4个基因被干扰后对孵化率均产生显著下降的影响。本研究对新发现的NlugCpr97单独的进行了 RNAi,并对其他5个已被单独研究过的基因又进行了联合干扰分析。结果表明NlugCpr97被干扰后,对卵的孵化率没有造成影响,胚胎可以正常发育。对其它五个基因联合干扰后不仅影响浆膜表皮的正常形成,卵孵化率更是低至5.16%,比任一基因单独干扰的33.95-75.87%孵化率低很多,表明不同CPR基因对卵孵化率影响有叠加效应,基因之间或许还存在着一定的功能互补。4.几丁质合成酶和多巴脱羧酶在浆膜表皮形成中的作用。表达谱分析发现几丁质合成酶基因(CHS1)从胚胎发育期到1龄初期有3个表达高峰,分别对应浆膜表皮、胚胎表皮和1龄若虫表皮的形成时期。在初羽化雌虫中对CHS1进行RNAi,浆膜表皮完全不能形成,表明CHS1对胚胎早期的浆膜表皮的形成不可缺少。多巴脱羧酶(DDC)是一类磷酸吡哆醛酶类,可以将L-多巴转化为多巴胺,对褐飞虱初羽化雌虫中的多巴脱羧酶(Nlddc)进行RNAi,浆膜表皮也不能形成,推测其对浆膜表皮的形成也是不可缺少的。5.一种新的表皮蛋白NICP21.92的鉴定。通过对褐飞虱组织转录组的分析,我们发现了一个在体壁上高表达的基因NlCP21.92,RT-qPCR和Western blotting分析显示该蛋白随着若虫的蜕皮存在周期性的表达模式,且表达产物只在体壁上被检测到。该基因ORF区域具有高GC含量特征。该蛋白序列中没有R&R共有序列以及其他几丁质结合保守结构域,但是存在AAPA/V序列以及其他一些表皮蛋白相关特征。对该基因进行RNAi会造成虫体变得干瘪缩小或少量的蜕皮困难的表型现象。TEM观察发现干瘪缩小虫体的内表皮变得很薄;而一些没有明显表型的个体,内表皮也出现部分的弯曲现象。冰冻切片免疫组织化学定位(IHC)结果显示该蛋白位于原表皮上,我们推测该蛋白可能是内表皮的一种重要的组分。6.对蛋白Nlegf-like的功能研究。通过对表皮蛋白数据库和褐飞虱组织转录组数据分析,鉴定了一个超大蛋白及其编码基因,其ORF全长达到50922bp,可编码一个含有16973个氨基酸的膜蛋白,氨基酸序列中含有260个EGF-like结构域,其中有16个是Ca2+结合形式(cbEGFs)。该基因在体壁上高表达,具有多种可变剪切转录本,不同转录本在龄期中期或末期高表达。系统进化树分析显示该基因在不同物种中具有保守性。用8段不重叠的双链RNA(dsRNA)分别干扰该基因后,虫体出现蜕皮困难或变瘦小最终死亡的表型。TEM观察表明:出现身体缩小表型的虫体,其内表皮变得很薄;而在龄期末身体伸长背板无法开裂或无法完成蜕皮的虫体,其旧表皮则没有被充分消化。因此我们推测该基因对表皮的新陈代谢发挥至关重要的作用。