转谷氨酰胺酶是一种转移酶,能够催化酰基发生转移反应,导致蛋白质分子内部和分子之间发生交联现象。由于其优越的交联特性,转谷氨酰胺酶被广泛应用在食品加工业的各个领域。本文主要通过交联反应将纯化后的转谷氨酰胺酶制备成交联酶晶体,探讨了交联酶晶体的结构特征和酶学性质,然后将交联酶晶体固定在聚丙烯微孔膜上,并对膜固定化酶在大豆乳清蛋白回收中的应用进行了初步研究。经过乙醇沉淀、硫酸铵盐析、超滤和凝胶层析4步纯化过程,将转谷氨酰胺酶进行了分离纯化,优化了分离纯化条件,获得了电泳纯的酶。经测定转谷氨酰胺酶被纯化了9.81倍,酶活回收率为28.54%,比活力达到100.97U/mg。选择PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、NEM、DTT、Na2S03、EDC和WRK等10种修饰剂对纯化酶进行小分子修饰,研究了转谷氨酰胺酶催化的关键基团,结果表明丝氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、半胱氨酸残基和赖氨酸残基位于酶的活性中心。通过对游离酶酶学特性的初步研究,发现游离酶的最适反应温度和最适pH值分别为40℃和6.0。同时游离酶在高温环境中的热稳定性较差,pH范围5～7之间可以保持较好的pH稳定性。此外,Ca2+、Mg2+、Ba2+等金属离子对转谷氨酰胺酶的活性几乎没有影响,而Fe3+、Zn2+、Cu2+对酶的活性有抑制作用,其中,Fe3+对酶活的影响最为显著。采用气相扩散法将纯化后的转谷氨酰胺酶制备成微晶体,利用双功能试剂戊二醛进行化学交联,得到了交联酶晶体。通过扫描电镜、偏光显微镜、傅里叶红外光谱、激光拉曼光谱、核磁共振光谱和X-射线衍射等技术手段对游离酶和交联酶晶体进行了结构表征,探讨了交联酶晶体的结构特性。比较分析了交联酶晶体和游离酶的基本酶学性质,发现交联酶晶体的最适反应温度变为45℃,最适反应pH为6.0。相对于游离酶,交联后的酶晶体的热稳定性、pH稳定性以及贮存稳定性都有显著提高,对于Fe3+、Zn2+和Cu2+的抑制作用也表现出明显的抵抗能力,并且交联晶体在水溶性有机溶剂中仍能保持较高的活性。选择紫外光引发聚丙烯微孔膜表面接枝固定化方法,对转谷氨酰胺酶交联晶体进行了膜固定化研究。采用响应面分析法对紫外接枝反应条件进行优化,确定了最佳的膜固定化方法。结果表明:照射距离为10.1cm,单体浓度为18.85%,二次照射时间为21.4min时,接枝率可达34.62%。转谷氨酰胺酶固定化的条件为:己二胺浓度为20%,胺烷基化时间90min,胺烷基化温度50℃;戊二醛浓度2%,戊二醛作用时间20min;酶晶体溶液浓度15mg/mL,4℃条件下固定化时间为24h。应用扫描电镜、傅里叶红外光谱和X-射线光电子能谱等手段对膜固定化酶进行了结构表征分析,同时对膜固定化酶的酶学性质进行了初步分析。结果表明膜固定化酶的最适反应温度提高到50℃,最适pH值仍然为6.0,热稳定性和pH稳定性相比游离酶和交联酶晶体均有所提高。另外膜固定化酶对Fe3+、Zn2+和Cu2+等离子抵抗的能力要明显高于游离酶和交联酶晶体,同时膜固定化酶具有良好的贮存稳定性和操作稳定性。在以上工作的基础上,进行了聚丙烯膜固定化转谷氨酰胺酶在大豆乳清蛋白回收中的应用研究。确定了膜固定化酶催化乳清蛋白聚合的最佳反应条件,比较了膜固定化酶处理前后大豆乳清废水中主要成分的变化情况,并采用SDS-PAGE凝胶电泳法,分析了聚合反应后乳清蛋白的分子质量,为进一步的转谷氨酰胺酶酶膜反应器的开发与应用提供了参考。结果表明,膜固定化酶在最佳的聚合条件下对蛋白质的截留率达到76%以上,经过酶处理后,废水中的低分子量大豆乳清蛋白转变成了高分子量的蛋白质。