H3K4me3是一种重要的表观遗传修饰,主要由MLL（mixed lineage leukemia）甲基转移酶复合体催化,对小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,m ESCs）自我更新能力的维持具有重要作用。ASH2L是MLL复合体中一个重要的核心亚单位,调控mESCs中染色质的开放状态。ASH2L在mESCs中有2个异构体:ASH2L-1（80 kDa）和ASH2L-2（65 kDa）,且以ASH2L-2的表达为主;而在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）中,只有ASH2L-1表达。目前,Ash2l-1和Ash2l-2在mESCs中的作用尚不清楚。本文利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,建立了Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs。利用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、qRT-PCR和拟胚体分化实验发现,Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs仍具有多能性,而Ash2l-1^-/-mESCs可能在外胚层和内胚层起源的器官形成方面具有发育缺陷。利用Western blotting、透射电镜、JASPAR和KEGG预测发现,Ash2l-1和Ash2l-2之间存在补偿效应,这种补偿效应可能是通过一些多能性转录因子介导实现的。本研究获得的主要结果如下:1.Ash2l-1/Ash2l-2在mESCs中的表达特异性用Western blotting检测ASH2L在mESCs和MEF中的表达。结果表明,ASH2L在m ESCs中存在ASH2L-1和ASH2L-2两个异构体,且以ASH2L-2的表达为主;而在MEF中,只有ASH2L-1表达。通过对比ASH2L-1和ASH2L-2的结构发现,ASH2L-1除了在N端比ASH2L-2多了一段长为89个氨基酸的序列外,其他的序列都与ASH2L-2相同。ASH2L-1和ASH2L-2都包含PHD、WH和SPRY结构域,但是二者由不同的启动子驱动表达:ASH2L-1由CpG岛启动子驱动表达,而ASH2L-2由长末端重复序列RLTR12B启动子驱动表达。2.Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs的建立利用在线网站分别设计靶向Ash2l-1-CpG岛和Ash2l-2-RLTR12B的gRNA,构建gRNA/Cas9打靶载体,通过PCR反应和测序鉴定,建立了Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs。结果表明,Ash2l-2^-/-mESCs敲除了Ash2l-2-RLTR12B启动子,Ash2l-1^-/-mESCs敲除了Ash2l-1-CpG岛启动子。3.Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs多能性的鉴定通过碱性磷酸酶染色发现,Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs在碱性磷酸酶的表达上与野生型对照无显著差异。通过免疫荧光染色和qRT-PCR实验发现,Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-m ESCs在多能性调控转录因子（Oct4、Nanog、Sox2和Klf4）的表达上与野生型对照无显著差异。拟胚体分化实验显示,Ash2l-1^-/-mESCs诱导的拟胚体在Snai2（外胚层标记基因）和Gata4（内胚层标记基因）的表达上显著低于野生型mESCs诱导的拟胚体（P<0.01）。4.Ash2l-1和Ash2l-2互补效应通过Western blotting发现,Ash2l-1^-/-mESCs中ASH2L-2的表达显著上调（P<0.01）,Ash2l-2^-/-mESCs中ASH2L-1的表达显著上调（P<0.01）。而Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs中,基因组H3K4me3的表达与野生型对照无显著差异。通过透射电镜观察发现,Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs中异染色质的表达与野生型对照无显著差异。利用JASPAR和KEGG预测分析发现,Ash2l-1和Ash2l-2启动子区分别具有3个和16个潜在的多能性转录因子结合位点。总之,本研究确定了ASH2L在mESCs中存在ASH2L-1和ASH2L-2两个异构体,且ASH2L-2具有m ESCs表达特异性。利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,建立了Ash2l-1^-/-和Ash2l-2^-/-mESCs并发现它们仍具有多能性,而二者的发育缺陷可能在细胞分化过程中才能体现出来。Ash2l-1和Ash2l-2之间存在补偿效应,这种补偿效可能是通过一些多能性转录因子介导实现的,参与mESCs多能性的维持、基因组H3K4me3和异染色质的调控,这为进一步研究Ash2l-1和Ash2l-2对mESCs的影响奠定了基础。