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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的革兰氏阴性条件致病菌。相比其他常见致病菌,铜绿假单胞菌依赖其层级排列的群体感应系统(Quorum-sensing,QS)通过复杂的胞内表达调控快速适应多种自然或临床环境,已成为危害国民健康和制约社会发展的重要病原菌。在慢性呼吸道多菌感染病灶中,病原菌之间通常存在着复杂的相互作用并显著影响疾病的进程。然而慢性呼吸道感染病灶中的优势病原菌铜绿假单胞菌与其他细菌性病原体的种间关系和相互作用机制仍有待探索。因此,本文主要聚焦慢性呼吸道感染常见病原菌铜绿假单胞菌和大肠杆菌(Escherichia coli)的种间相互作用关系并开展了如下研究:(1)通过对临床慢性阻塞性肺病患者痰液样本中的病原菌分离鉴定,确定了痰液样本中病原菌占比信息。在25例痰液样本中,有11例样本检出链球菌属病原菌;有5例AECOPD样本检出铜绿假单胞菌;4例样本检出大肠杆菌;4例样本检出粪肠球菌;2例样本检出蜡样芽胞杆菌;2例患者的样本检出棒状杆菌;1例患者样本检出表皮葡萄球菌。选取分离至同一样本的铜绿假单胞菌COP2和大肠杆菌COP1512与实验室常用的铜绿假单胞菌模式菌株PAO1采用微量肉汤稀释法进行临床常用抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)实验,结果表明PAO1对氨苄西林表现出耐药性,COP2对头孢噻肟、氨苄西林、美罗培南、亚胺培南表现出耐药性,COP1512表现出对亚胺培南的耐药性;(2)分别构建铜绿假单胞菌PAO1、COP2与大肠杆菌COP1512的平板互作实验模型,发现PAO1和COP2均表现出对COP1512的抑制作用,并且随着培养天数的增加,靠近PAO1和COP2生长的COP1512被抑制得更明显,而大肠杆菌COP1512的存在对铜绿假单胞菌的生长没有明显影响。这些结果表明共培养过程中铜绿假单胞菌与大肠杆菌相比具有显著的竞争优势;(3)利用转录组测序进一步研究铜绿假单胞菌PAO1与大肠杆菌COP1512互作过程中胞内基因表达的变化,发现铜绿假单胞菌PAO1在与大肠杆菌COP1512等比例混合培养及距离培养1天后,未检测到明显的基因表达差异及代谢通路的变化,但在距离培养4天后发生了较大范围的胞内表达变化。将这些显著差异表达的基因对应到QS基因调控列表时发现lasR、rhlR等QS关键调控基因表达降低,而PQS、氰化物、绿脓菌素和H2-T6SS(IV型分泌系统)等生物合成有关的基因表达量增加。大肠杆菌COP1512在与PAO1互作中胞内有491个基因表达量降低和378个基因表达量升高。这些表达量降低的基因主要集中在细胞的有氧代谢方面,而表达量升高的基因主要集中在厌氧代谢和膜转运相关方面;(4)基于转录组结果中铜绿假单胞菌QS系统差异表达的基因进行基因敲除实验,进一步研究QS缺陷菌株与大肠杆菌的相互作用关系。结果发现随着培养天数的增加,铜绿假单胞菌突变菌株PAO1-ΔlasR、PAO1-ΔrhlR、PAO1-ΔmvfR、PAO1-ΔmvfRlasR均对大肠杆菌表现出不同程度的抑制作用。与野生型PAO1菌株相比,所有突变菌株对大肠杆菌的抑制作用明显降低,特别是PAO1-ΔmvfRlasR双突变菌株对大肠杆菌的抑制能力最弱。铜绿假单胞菌临床菌株COP2的lasR突变株同样也表现出对大肠杆菌的抑制作用。研究还发现大肠杆菌COP1512的上清液能够促进PAO1-ΔlasR菌绿素的合成。通过荧光定量PCR发现大肠杆菌COP1512的上清液能够刺激铜绿假单胞PAO1、PAO1-ΔlasR胞内中rhlR、mvfR及其下游功能基因phzA和pqsE的表达;(5)通过构建秀丽隐杆线虫感染模型研究铜绿假单胞菌PAO1与大肠杆菌COP1512的种间互作对宿主的致病性,结果发现COP1512的上清液能够增强PAO1、PAO1-ΔlasR对秀丽隐杆线虫的致死能力。上述研究成果深入揭示了慢性呼吸道感染主要病原菌铜绿假单胞菌与大肠杆菌的种间互作机制,有望为未来更为复杂的多病原菌种间互作机理的揭示和多病原菌慢性呼吸道感染形成机制的阐明奠定理论和事实基础。