农杆菌是土壤中的一种革兰氏阴性植物病原菌,它能使许多植物产生肿瘤。农杆菌中比较常见的种类是根癌农杆菌和发根农杆菌,其中根癌农杆菌研究最多。根癌农杆菌的Ti质粒(tumor inducing plasmid)会引起冠瘿瘤疾病。农杆菌能介导Ti质粒的致瘤部分(T-DNA)转运到植物细胞,并且T-DNA能在植物染色体中稳定存在。如果用目的基因替换T-DNA,目的基因就能在植物细胞中表达,这就是目前被广泛使用的农杆菌介导的遗传转化方法,但是这种转化法仍然存在转化效率低、转化效果不可预测等问题。VBPs (VirD2-binding proteins, VBPs)能与VirD2特异性结合,并参与了农杆菌的致瘤过程。VBPs能将T-复合物聚集到VirB/VirD4 IV型分泌系统(type IV secretion system, T4SS)转运位点,并且VBPs在与VirB/VirD4 T4SS不同的转运系统中也具有招募接合质粒的功能,因此,这类蛋白又被叫做“招募蛋白”。VBP蛋白高度保守,在农杆菌中存在3个拷贝的同源基因,其中atu5117基因位于At质粒上,而atu4856、atu4860位于线形染色体上,这2个同源基因位置很近且atu5117与接合转移基因只间隔3 kb。我们期望通过研究atu4860启动子的分子调控机理,探究VBPs的功能,从而有效提高转化效率。研究农杆菌atu4860(vbp2)基因启动子活性的调节机制,最关键的是能对atu4860基因启动子的活性进行定量测定。因此,我们通过双荧光报告载体的构建,建立了启动子活性定量检测的方法。该双荧光报告载体去除了pUCA19质粒自身所带的lacZ’启动子,反向插入了两个DNA片段。一个片段为组成型atu3617启动子与红色荧光蛋白(redfluorescent protein, RFP)报告基因连接,另一个片段为atu4860启动子与增强型绿色荧光蛋白报告基因(enhanced green fluorescent protein, eGFP)连接。该双荧光报告载体的构建,满足了四点要求：能在大肠杆菌和农杆菌中复制表达、自身无启动子影响实验结果、能消除质粒拷贝数的影响、能定量atu4860启动子的活性。在双荧光报告载体构建成功的基础上,通过荧光显微镜进行定性观察,发现atu3617启动子和atu4860启动子在大肠杆菌DH5α和农杆菌GMI9017△vbp2中都能启动报告基因表达。通过荧光分光光度计进行定量检测,发现以细菌总蛋白的荧光强度表征总蛋白中荧光蛋白含量的方法比以活细胞的荧光强度定量表征荧光蛋白表达量的方法更可靠,且以红色荧光强度为内参,可用绿色荧光强度与红色荧光强度的比值代表atu4860启动子活性。本实验通过生长曲线的测定,发现荧光蛋白在细菌内的表达不会影响细菌的生长。致瘤因素乙酰丁香酮(AS)、pH对atu4860 (vbp2)有一定的调控作用。在AS浓度和pH的诱导实验中,我们发现在AS浓度100～200 μM和pH 5.0～6.5时,atu4860的启动子活性较强。这个结果与AS的有效使用浓度一般在50～200μM的范围有一致性,与Vir区基因诱导达最高水平时所需要的pH 5.2～6.0的范围有一致性。因此,atu4860启动子的活性受到AS浓度和pH的影响,并且atu4860可能与Vir区基因的诱导表达有某些联系。