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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,可感染包括人在内的几乎所有的温血动物,在世界范围内广泛分布。T.gondii感染可引起宿主严重的脑病、眼病、流产、死胎等,严重危害人类的健康,并给畜牧业造成巨大的经济损失。T.gondii在中间宿主体内存在速殖子和缓殖子2种形态,现有药物的治疗仅对虫体的速殖子时期起作用,对于包囊内的缓殖子收效甚微,且药物的使用存在一定的毒副作用。近年来,国内外学者认为开发疫苗免疫宿主可能是防控弓形虫病有效措施。但目前尚无有效疫苗可用于弓形虫病的防控,其关键原因在于未寻找到合适的靶标基因。研究表明,T.gondii棒状体蛋白在虫体入侵宿主细胞和对宿主细胞毒力方面都发挥着重要作用。其中,ROP54作为一种位于纳虫空泡膜上的棒状体蛋白假定激酶,在调节纳虫空泡上鸟氨酸相关蛋白载量及T.gondii毒力等方面发挥着重要作用,但关于它的生物学功能及免疫保护效果尚不明确。本研究首先构建了含有T.gondii ROP54基因的pVAX-ROP54核酸疫苗,以该疫苗对昆明鼠进行3次免疫后,测定免疫小鼠的各项体液免疫和细胞免疫指标,以及脾细胞增殖能力,并评价其抵抗不同毒力T.gondii的免疫保护力。通过抗体水平检测,发现pVAX-ROP54核酸疫苗免疫组小鼠与对照组相比,IgG抗体水平显著升高,且IgG2a的抗体水平高于IgG1,表明该核酸疫苗引起了以Th1型为主的体液免疫应答;通过细胞因子水平检测,发现免疫组小鼠细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12(p70)与对照组相比均显著升高,且与Th1型反应相关的细胞因子水平高于Th2型,表明该核酸疫苗可刺激免疫机体产生以Th1型反应为主的细胞免疫应答;通过动物感染试验,发现免疫组小鼠存活时间相比对照组可延长大约7 d,小鼠脑包囊数降低35.9%,表明该核酸疫苗可为免疫小鼠提供较好的免疫保护力抵抗T.gondii的急性和慢性感染。随后,本研究采用CRISPR/Cas9基因敲除技术对T.gondii PRU株的ROP54基因进行了敲除,利用所构建的基因敲除株研究ROP54基因对虫体的体外的增殖能力、在小鼠体内的毒力和包囊形成能力的影响来进一步研究ROP54基因的生物学功能。通过噬斑试验,发现PRU-ΔROP54株在体外感染HFF细胞时,其虫体增殖能力显著低于野生PRU株;通过毒力试验,发现该基因敲除株感染组与野生株感染组相比,其小鼠存活率显著升高;通过包囊形成试验,发现PRU-ΔROP54株感染组小鼠脑包囊显著低于野毒株感染组。综上所述,本研究成功构建了pVAX-ROP54核酸疫苗及T.gondii ROP54基因缺失株(PRU-ΔROP54),并评价了其免疫保护性,发现ROP54具有一定的免疫原性,所构建核酸疫苗可诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答,相比T.gondii PRU株,PRU-ΔROP54株增殖能力和毒力显著降低,包囊形成能力减弱。但是,无论是ROP54核酸疫苗还是缺失株均无法对小鼠提供完全的免疫保护力,不宜用作抗T.gondii感染的疫苗。