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生物药从出现至今凭借卓越的疗效、生物科技的快速发展以及研发投入的不断增加,已成为制药行业近年来发展最快的子行业。2019年生物药的全球市场规模已超过3000亿美元,其中抗体类相关药物(完整抗体、Fc融合蛋白、双特异性抗体等)占据了大部分。中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)因具有较理想的翻译后修饰功能,一直是生物药制备的主要表达载体。在已经上市的抗体类药物中约7成都是在CHO细胞中生产的。虽然利用CHO细胞进行抗体类药物制备的产量在过去的几十年有了很大提升,但面对市场规模的不断加大,其产能仍难满足需求,所以提高CHO细胞株的产量具有重要的现实意义。Fc融合蛋白与完整抗体相比,没有轻重链之间的相互作用,在表达机制上必然有所不同,为了了解CHO细胞中与Fc重组蛋白产量相关的部分机制,本研究首先对CHO-K1贴壁细胞进行了无血清全悬浮驯化,然后利用编码有G1p1-Fc融合蛋白的质粒进行转染,通过单克隆筛选获得了 5株具有不同重组蛋白表达水平的CHO细胞,各细胞株的产能经过ELISA及免疫荧光观察的双重确认后对各细胞株进行RNA-seq转录组学测序分析。为使后续的试验结果能够尽量客观地反应胞内的相关机制,对该研究条件下的内参基因进行了鉴定,候选基因的三个来源分别是:(一)常用的管家基因:(二)已报道的表达完整抗体的CHO细胞中的内参基因;及(三)我们转录组测序结果中选出的基因。从中选择了 20个候选基因在多个试验条件下进行分析鉴定,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper和ACt四种不同的程序与算法,最终确定了在75天长期培养中基因Akrlal、Gpxl和Aprt及加料培养中的基因Akrlal和Rps16分别显示出了最高的表达稳定性,适宜用作内参基因进行校正。上述基因均是未报道过的适用于表达Fc融合蛋白的CHO细胞中的内参基因。基因Pabpn1,Hirip3和Actb在两种培养过程中的表达稳定性均最低。通过比较利用不同表达稳定性的内参基因对目的基因作校正时,基因相对表达量会有明显不同甚至完全相反的结果显示出选择适宜内参基因的重要性。该工作为表达Fc融合蛋白的CHO细胞中相关研究提供了更为稳定的可选择的内参基因。通过分别比较高产、中产、与低产细胞株的转录组数据,分析差异表达基因、差异表达基因GO功能分析、差异表达基因通路功能分析以及差异表达基因蛋白互作分析等,获得20个可能与Fc融合蛋白产量相关的潜在目标基因,然后利用鉴定出的内参基因对上述20个潜在目标基因进行RT-qPCR验证,其中12个基因得到与转录组分析相似趋势的结果并作为RNA干扰试验的初筛对象。经过mRNA水平与重组蛋白表达水平的复证,确定基因thbd和medag的下调对GLP1-Fc融合蛋白的产量分别具有降低和提高的作用。最后利用shRNA载体对高产株CHO-12构建沉默medag基因的稳定细胞株,进一步验证该基因对重组蛋白表达的影响及初步作用机制,通过逐级扩大的筛选最终获得基因medag表达下调的稳定细胞株CHO-12-medag-2E9。对该细胞株进行生长参数的检测发现与对照细胞株相比,Fc融合蛋白的表达量增加了 13%,倍增时间缩短1.6小时(7%),推测蛋白产量的增加可能是由于生长速度加快所引起。为后续该基因的相关作用机制的研究,弥补该基因极其有限的生物学信息提供了试验基础。