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研究背景：大肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，致死率较高，约占所有癌症死亡人数的8%，是目前继肺癌、胃癌及肝癌之后第四大最常见的癌症死亡原因。近年来，大肠癌的发病率有上升的趋势。因此大肠癌的分子机制仍有待进一步阐明，其中细胞恶性增殖是导致大肠癌发生发展的一个重要原因。PIN1（peptidy-脯氨酰顺/反异构酶PPIase）是一个高度保守的、特定的肽基脯氨酰顺反异构酶的家庭成员，它在包括大肠癌在内的不同类型的恶性肿瘤过度表达。Pin1蛋白中含有一个的N端的WW结构域和一个C端的异构酶结构域。WW结构域与p-Ser/Thr-Pro基序特异性结合，使之发生顺反异构，从而改变目的蛋白的空间构型，进一步改变目的蛋白功能，调节蛋白与蛋白之间的相互作用。Pin1蛋白可参与多种控制细胞生长和转化的信号转导通路，包括P53，E2F，NF-κB，CyclinD1，Cdc25C蛋白，β-catenin，AP-1，NFAT，NIMA和Wee-1。目前，Pin1蛋白已作为抗癌剂的药物靶标之一。而我们先前的研究已成功构建质粒pGenesil-1-Pin1,它具有短发夹结构，可有效下调Pin1基因的表达。最近研究表明，抑制Pin1导致人类细胞中端粒逐步缺失。端粒作为染色体的末端，由人类染色体的末端重复序列d(TTAGGG)n和相关蛋白构成。端粒可以保持染色体稳定性，但会随着细胞分裂逐渐缩短。而端粒酶则可添加端粒重复序列到3’末端端粒区，以维持端粒长度，保持基因组稳定性。在大部分正常人体细胞和组织中，端粒酶没有活性，但在大多数肿瘤细胞，包括直结肠癌组织中，该酶是有活性的。该酶的核心组成蛋白催化亚基——端粒酶逆转录酶(TERT)，由人TERT基因(hTERT)编码，而hTERT的转录很大程度上取决于其启动子活性。研究表明，多种调节蛋白可与hTERT基因启动子区域结合，如c-myc，SP1，P53，E2F和NF-κB/p65。近期报道表明，抑制端粒酶的表达，抑制端粒酶活性可能成为一个新的肿瘤基因治疗的目标。目的：研究在人类大肠癌HCT116细胞中，抑制Pin1基因对端粒酶活性的影响及其作用机制。方法：1.扩增Pin1基因干扰表达载体pGenesil-1-Pin1（缩写P-shRNA）和对照载体pGenesil-1-CON(简写p-CON)，双酶切载体后，经1%琼脂糖凝胶电泳及DNA测序鉴定载体。2.利用脂质体将质粒p-shRNA及其对照组p-CON转入大肠癌HCT116细胞，通过观察转染48h后HCT116细胞绿色荧光蛋白表达量，计算转染效率。3.提取各组HCT116细胞总RNA，利用qRT-PCR检测Pin1在各组大肠癌HCT116细胞RNA表达情况；提取各组细胞总蛋白，利用Westernblotting检测其Pin1蛋白表达水平的情况。4.采用流式细胞检测HCT116细胞转染p-shRNA质粒及p-CON质粒后的凋亡率。5.提取各组细胞端粒酶，利用TRAP-银染法分析端粒酶逆转录酶在各组人类大肠癌HCT116细胞的活性水平。利用qRT-PCR检测hTERT在各种大肠癌HCT116细胞的RNA表达情况。6.利用免疫荧光与Westernblotting检测p-NF-κB/P65在各组HCT116细胞中的定位及聚集情况。利用DNA电泳迁移率变动分析(EMSA)检测在各组HCT116细胞中NF-κB/P65与hTER的结合活性。结果：1.经鉴定确认成功提取Pin1基因的RNA干扰表达载体。2.利用脂质体介导质粒pGenesil-1-Pin1转染HCT116细胞后，观察绿色荧光蛋白，计算其转染效率达61%。3.qRT-PCR结果显示：转染质粒pGenesil-1-Pin1后，Pin1的表达明显下调(0.392±0.072-fold(P=0.001))，Pin1表达抑制率达61.8%。Westernblotting检测也支持该结果。4.流式细胞检测结果显示：下调Pin的表达可使细胞凋亡率上调(16.40％±1.54％(P<0.05))。5.TRAP-银染法结果显示：转染质粒pGenesil-1-Pin1后，端粒酶活性显著下调(0.384±0.015(P<0.05))，其表达抑制率达60.28%。qRT-PCR结果显示：转染质粒pGenesil-1-Pin1后，hTERT转录表达显著减少(0.171±0.060-fold(P=0.001))，其表达抑制率达61.8%。6.免疫荧光和免疫印迹结果显示p-NF-κB/p65主要聚集于细胞核且其聚集量随Pin1下调而下调。电泳迁移率变动分析(EMSA)，证明NF-κB/P65蛋白能与hTERT启动子结合，其结合力随Pin1下调而下调。结论：1.经实验证实，成功提取Pin1基因的RNA干扰表达载体，使用该质粒转染大肠癌HCT116细胞可抑制Pin1基因的表达。2.经实验证实，下调Pin1基因表达可以有效促进人大肠癌HCT116细胞凋亡；同时可以抑制该细胞中端粒酶活性。3.经实验证实，下调Pin1基因可减少有活性的NF-κB/p65在核内的积聚量，减少NF-κB/P65和hTERT基因启动子的结合。使hTERT基因表达下调，进而影响hTERT基因的生物学作用，抑制端粒酶活性，为大肠癌基因治疗提供了新的思路和方法。