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猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是小核糖核酸病毒科,心病毒属的成员之一。EMCV基因组全长大约7.8 kb,为单股正链RNA,可以直接作为模板翻译成一个大的多聚蛋白(polyprotein)。该蛋白被EMCV的蛋白酶3C(3Cpro)切割成13个成熟的蛋白。EMCV 1D蛋白是病毒的衣壳蛋白,位于病毒粒子的表面,可以与细胞受体相互作用,是EMCV入侵的关键蛋白。早期研究发现,EMCV 1D蛋白含有许多可以与EMCV感染动物的阳性血清反应的的抗原表位,这是建立EMCV检测方法的基础。EMCV的感染谱比较广泛,可以感染多种动物,包括灵长类。猪对EMCV最敏感。幼年猪感染EMCV可能会发生急性心肌炎并猝死,成年猪感染EMCV往往呈亚临床症状。母猪感染EMCV可以导致繁殖障碍。在2005年,我国首次从不同地区采集的临床样品中分离出了EMCV病毒,随后不同课题组相继报道从不同猪场分离出EMCV的野生毒株。血清学调查结果表明,EMCV在我国规模化养殖场存在,提示EMCV已经对我国生猪产业造成了威胁。有研究结果表明,EMCV可以感染人,因此开展对EMCV的监测与防控具有重要的公共卫生意义。本研究利用纯化的EMCV 1D蛋白成功建立EMCV ELISA检测方法,同时利用小鼠为模型,制备和评价了EMCV的灭活抗原。具体的内容如下:(1)EMCV间接ELISA检测方法的建立本研究通过Ni柱亲和层析的方式得到了高浓度的EMCV 1D蛋白,蛋白的浓度可高达1.5mg/mL。利用纯化的EMCV 1D蛋白包被96孔板,我们成功建立了针对1D血清抗体的EMCV间接ELISA检测方法并对ELISA反应各个条件进行了优化,得到了最佳的ELISA反应条件为:重组1D蛋白的包被浓度为1μg/mL;待检样品的稀释浓度为1:2000;用5%的脱脂乳在37℃封闭1 h;待检样品的作用时间为1.5 h;酶标抗体的稀释度为1:5000,且作用时间为30 min;底物的作用时间为10 min。(2)EMCV灭活抗原的初步评价本研究采用BEI对EMCV HB10进行灭活,配合疫苗佐剂ISA 15VG得到了EMCV灭活抗原。分别采用不同剂量的灭活抗原免疫小鼠,在免疫和攻毒试验后,通过本研究建立的间接ELISA方法检测到免疫小鼠血清中1D抗体,表明灭活抗原可以很好的激发小鼠的特异性免疫应答。并且攻毒后,对照组小鼠表现出明显的临床症状,病理变化明显,组织病毒载量较高并且相继死亡,只有一只小鼠存活。但免疫组小鼠临床症状并不明显,且没有明显的病理变化,组织病毒载量较低,全部存活下来。这表明我们制备的EMCV灭活抗原可以做为EMCV的候选疫苗,该灭活抗原可以保护小鼠免于攻毒死亡。综上所述,本研究建立了EMCV 1D间接ELISA检测方法,制备的灭活抗原可以保护小鼠免受强毒株的攻击。