抗生素的滥用导致了大量的耐药菌株的出现，寻找结构特异的新型药物来对抗这些耐药菌已经成为当务之急。抗菌肽是具有强抗菌作用小分子多肽，是生物先天免疫的重要组成成分，可保护机体免受革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌、病毒等病原微生物的入侵，有望部分替代抗生素。鱼类是水生生物群的重要组成部分，水环境中有上千种鱼类，而每种鱼类又可以分泌几种不同结构的抗菌肽。本文主要研究其中两种，种是斑点叉尾鮰和鲤鱼来源的抗菌肽杀菌/渗透增强蛋白（bactericidal/permeability increasing protein，BPI），另种是斑点叉尾鮰来源的肝脏表达的抗菌肽2（liver-expressed antimicrobial peptide2，LEAP2）。国内外有关这两种鱼类来源抗菌肽的基因工程方面的报道很少。BPI是生物机体细胞中表达的种能够特异性杀灭革兰氏阴性菌的抗菌类蛋白，该蛋白包括氨基端和羧基端两个结构域，其中氨基端结构域主要承担杀菌和中和内毒素的功能。参考已经报道的对人类BPI进行重组DNA表达的研究结果，首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）鳃中克隆了编码BPI氨基端活性结构域的cDNA片段BPINtd以及含有终止密码子的片段BPINtdcf，此两个片段均由175个氨基酸残基组成，其中63个氨基酸残基在空间上形成个非极性的脂质结合袋，与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖（LPS）结合，从而改变细菌膜的通透性，达到杀菌的效果。根据斑点叉尾鮰与其他生物之间BPI氨基酸序列的比对结果，发现氨基端存在40个保守的氨基酸残基，其中9个高度保守的残基位于脂多糖结合区域内。为了进步建立原核表达系统，根据pET-32a（+）和pET-28a（+）两种质粒的不同特点，选择其作为原核表达质粒，将BPINtd片段分别插入两种质粒，通过菌落PCR、EcoR I和Hind III双酶切反应以及DNA测序等方法，证明了重组表达质粒pET-32a-BPINtd和pET-28a-BPINtd已被成功构建。同时将BPINtdcf将该片段插入到pET-28a（+）中，通过菌落PCR、Nde I和Bam HI双酶切以及DNA测序等，证明重组表达质粒pET-28a-BPINtdcf被成功构建。本文通过RT-PCR和巢式PCR从鲤鱼（Cyprinus carpio）鳃中克隆了编码BPI氨基端的活性结构域BPINtdcp，该片段由211个氨基酸残基组成，也包含由63个氨基酸残基组成的脂多糖结合位点。将该片段插入到pET-28a（+）中，通过菌落PCR、 Nde I和Hind III双酶切以及DNA测序，证明了重组表达质粒pET-28a-BPINtdcp被成功构建。肝脏表达的抗菌肽2（LEAP2）最先是从人血液超过滤产物中得到了含有2对二硫键的肝脏表达的抗菌肽。本文以斑点叉尾鮰肝脏为基因克隆的材料，通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类及哺乳动物LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果，发现存在14个保守的氨基酸残基，其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域，在空间上可形成2对二硫键，被推测与LEAP2的抗菌活性有关。进步构建重组表达质粒pET-32a-mLEAP2，使mLEAP2基因与携带有6x His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合，转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，在25°C下，经0.7mmol/L IPTG诱导培养16h后，成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示，细胞经超声破碎后，上清和沉淀中均含融合蛋白，采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行纯化，得到了纯化的融合蛋白。本文进步以mLEAP2为模板重新克隆，克隆后得到的新的片段mLEAP2kex2含有Xho I和Xba I的酶切位点以及Kex2酶识别位点AAAAGA，这个酶切位点的加入可以使α因子信号肽与外源片段的融合蛋白分泌到胞外后，α因子信号肽被Kex2酶切除，这样可以得到具有天然N段的mLEAP,以确保抗菌肽的活性。接下来将该片段mLEAP2kex2插入到真核表达载体pGAPZα A中，通过菌落PCR鉴定和测序验证证明成功构建了真核表达载体pGAPZ-mLEAP2kex2，为其在毕赤酵母中的表达奠定了重要基础。本研究加深了人们对鱼类来源的抗菌肽的认识，有助于开发研制新型抗菌肽类药物来对抗耐药菌株，并将其应用于在医学、养殖业、农业等领域。