论文部分内容阅读
脊髓损伤病人在世界各地以平均每年15-40/百万人口的比例增长,在每年新增的大量脊髓损伤病人中,有很大一部分是脊髓轴突连续性仍然存在的不完全损伤,到目前为止,唯一能够改善神经学功能的药物治疗是静脉应用甲基强的松龙。但治疗效果却不令人满意,最终的恢复程度与受损情况并非完全一致,脊髓功能的障碍往往较原发性的脊髓结构损伤更加严重。这主要是因为在遭受机械性损伤后,脊髓发生的一些生化和细胞层面的变化,加重了神经细胞和神经传导束的损伤,最终导致了不可逆性的功能损害。这种脊髓遭受损伤后引起的一系列病理生理变化,称之为继发性损伤(Second Spinal Cord Injury,SSCI)。对脊髓继发性损伤的研究表明,脊髓的缺血缺氧是引起脊髓继发性损伤的主要机制,即所谓的“血管机制”在其中发挥重要的作用。脊髓损伤后导致受损区以及临近区域的正常组织缺血缺氧,并且在后续的恢复和治疗过程中出现再灌注,在这个过程中,出现了一系列的病理变化。对脊髓缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/P)机制的研究发现,脊髓缺血后,可以引起一系列的瀑布反应,主要包括:1. 兴奋性氨基酸毒性。2. 内源性阿片肽。3. 自由基损伤。4. 钙离子通道开放。5. 脂质过氧化反应。6. 一氧化氮毒性。7. 内皮素及血管生长因子/渗透性因子。8. 血小板活化因子等。其中,细胞内钙离子内流被认为是神经系统毒性细胞坏死的公共通路。由钙离子诱发的下游病理性生化级联反应,主要由中性、钙依赖性蛋白酶——钙蛋白酶(calpain)所介导。由钙离子诱发的calpain过度激活似乎是多种形式神经变性的共同病理途径。换言之,由calpain介导的病理过程,是神经系统疾病的共同致病途径。为了进一步了解在脊髓遭受机械性损伤后的缺血再灌注阶段,即脊髓的继发性损伤阶段,calpain对脊髓神经功能损伤所起的作用,本实验以单纯脊髓缺血再灌注损伤的动物模型为研究对象,探讨了calpain在脊髓I/P损伤中的意义。以免疫组化法观察了损伤后不同阶段脊髓组织中calpain的表达,以Western Blot法观察了其特异性底物68-KD NFP的降解。并对脊髓组织中神经细胞的凋亡和其他病理学改变进行了观察。对动物的后肢运动功能进行评分,以代表缺血再灌注损伤对脊髓功能的影响。在损伤后应用calpain的特异性抑制剂E-64-D和<WP=7>国际公认的治疗脊髓损伤的药物甲基强的松龙对实验动物进行治疗,观察两种药物对大鼠脊髓缺血再灌注后calpain表达和活性的影响以及对脊髓功能的保护作用,希望为脊髓继发性损伤的治疗寻求新的途径和思路。实验动物选用雄性成年SD大鼠,以结扎右肾动脉分支下方腹主动脉的方法,造成动物脊髓缺血性损伤。30分钟后,松开动脉夹,对缺血脊髓进行再灌注。在损伤后3h,24h,72h和7d观察了受损节段脊髓组织中calpain-Ⅰ的表达和其特异性底物68-KD NFP的降解。结果证实,在大鼠脊髓缺血再灌注损伤后,calpain-Ⅰ的表达增加,活性增强,对细胞骨架蛋白产生特异性的降解作用,引起神经细胞凋亡,使神经细胞和神经传导束受损,最终对脊髓的功能产生破坏。同时发现,结扎左肾动脉以上,右肾动脉以下腹主动脉的方法,可以在一定程度上造成脊髓的缺血,但由于脊髓血供得益于来自头端和尾端的代偿,所以其损伤是不完全的,所以可以通过调整缺血时间进行控制,是一种良好的研究脊髓缺血再灌注损伤或继发性损伤的动物模型。对损伤后72h 动物后肢功能评分证实,脊髓缺血再灌注后脊髓的运动传功能被不同程度的损害。而calpain-Ⅰ的表达和活性,以再灌注损伤后72h时为最明显,这一现象表明,calpain-Ⅰ的活性可以持续相当长的一段时间,在损伤的后期,仍然可以对组织细胞的结构造成新的破坏,提示我们calpain-Ⅰ在脊髓继发性损伤中起着一定的作用,而且脊髓缺血再灌注时的病理变化是缓慢加重的,calpain-Ⅰ的激活、表达和损耗都有一定的缓冲时间,可以在一个比较长的时段内保持在一个动态、相对稳定的水平,逐渐达到峰值。针对calpain的特异性抑制剂对脊髓继发性损伤的治疗,可能具有较长的治疗窗。在缺血30分钟后立即静脉应用calpain的特异性抑制剂E-64-D后,calpain-Ⅰ的表达和活性得到明显的抑制,表现为calpain-Ⅰ阳性表达的减弱,68-KD NFP的降解得到一定程度的抑制,脊髓组织中神经细胞的凋亡减少,病理改变减轻,存活神经元数目增多。动物后肢运动功能评分也显示脊髓的运动传导功能得到保护。这些观察结果与文献中报道的在动物大脑缺血再灌注损伤后calpain表达和降解活性的变化规律相一致。也符合脊髓机械性损伤后受损节段临近缺血半影区(Penumbra)中calpain的表达规律。说明在受损后应用calpain的特异性抑制剂,可以通过抑制calpain的表达和活性,有利于神经细胞的存活和神经传导束的完整性。对脊髓的功能产生确实有效的保护作用。calpain特异性抑制剂<WP=8>的研究和临床应用,是值得重视的一个治疗脊髓继发性损伤的重要思路。作为国内外公认的治疗脊髓损伤的标准药物,甲基强的松龙可以对脊髓的继发性损伤起到一定的治疗作用,但其治疗时机要求甚高。其作用机理尚未完全明了,对其在继发性脊髓损伤整个病理过程中的作用环节还未完全阐明。一般认为是通过抑制脂质过氧化物反应,发挥作用。包括:稳