论文部分内容阅读
背景子宫内膜异位症（Endometriosis,EM）是指子宫内膜组织腺体和间质在子宫以外的部位生长的雌激素依赖性妇科疾病。EM在生殖年龄妇女中的发病率为1015%;不孕妇女中有20%50%患有EM,而30%50%的EM妇女患有生殖能力低下或者不孕。EM性不孕症发病机制复杂,目前尚无理想的治疗方案,严重影响了患者的生活质量,越来越受到医学研究者们的关注。内异方是导师俞超芹教授临床治疗EM性不孕症的有效中药复方,在多年来的临床实践中取得了良好的疗效,但其确切的作用机制目前尚不明确。目的1、采用模拟经期的内膜组织,腹腔注射方式建立EM小鼠模型。2、观察EM模型小鼠的生殖能力,探讨影响EM小鼠生殖能力的可能机制。3、探讨内异方对EM模型小鼠生殖能力的影响,并从卵泡发育、盆腔微环境、盆腔粘连的角度探讨内异方的作用机制,为内异方的临床推广应用奠定基础。方法1、采用5只C57BL/6小鼠和4只增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）转基因小鼠作供体,20只C57BL/6小鼠作受体。模拟供体小鼠的月经周期,将其经期子宫内膜组织剪碎后分别注射入受体小鼠的腹腔。普通模型组接受C57BL/6供体小鼠的子宫内膜碎片,EGFP模型组接受EGFP供体小鼠的子宫内膜碎片。3周后模型建立成功。通过小动物活体成像、大体解剖、病理形态学观察的方式,了解此造模方法的成模情况;将2组模型小鼠内异灶大小、数量和盆腔粘连评分进行统计学比较,选择最优造模方式。2、建立EM小鼠模型,设为模型组（n=21）,并设立假手术组（n=21）,空白组（n=15）,共3组。通过阴道脱落细胞学方法对小鼠动情周期进行观察,于动情前期随机处死模型组和假手术组各6只小鼠,取其卵巢组织进行组织形态学观察;于动情间期对剩余3组小鼠行眶静脉采血。将3组小鼠与性成熟雄鼠随机2:1比例合笼,进行交配实验,合笼至出现阴栓,见栓记为妊娠第1天。孕鼠于妊娠18天脱颈处死,处死后取腹腔冲洗液;模型组不孕小鼠行阴道涂片,于动情间期采血,脱颈处死后取腹腔冲洗液。通过大体解剖法,观察3组小鼠妊娠情况、胚胎情况,以及模型组小鼠内异灶、盆腔粘连情况。通过酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测动情间期小鼠血清性激素（FSH、LH、E2、PRL）水平和糖类抗原125（carbohydrate antigen 125,CA125）水平,以及腹腔液中白介素-2（interleukin-2,IL-2）水平。通过动情周期、交配实验、大体解剖、卵巢组织形态学观察结果和ELISA检测结果,了解EM模型小鼠的生殖能力及盆腔微环境、盆腔粘连的状况,探讨其生殖能力下降的可能机制。3、建立EM小鼠模型78只,按随机数字法将其分为内异方组（n=26）、孕三烯酮组（n=26）、模型组（n=26）3组,并设立假手术组为正常对照组（n=26）。连续药物干预15天,同时停药。药物干预结束后每组随机选择6只小鼠,于动情前期处死,取其卵巢组织行组织形态学观察。药物干预第15天傍晚行交配实验,雌雄比4:1,连续合笼15天。大体解剖观察4组小鼠妊娠结局和胚胎情况,以及EM模型小鼠的内异灶、盆腔粘连情况。对4组小鼠肝、脾、肾脏进行组织形态学观察。ELISA方法检测腹腔液中炎症因子IL-2、IL-6和IL-10的水平。通过交配实验、大体解剖和卵巢组织形态学的观察结果和ELISA检测结果,了解内异方对EM模型小鼠生殖能力的影响,及对卵泡发育、盆腔微环境和盆腔粘连的改善作用。结果1、用模拟经期内膜组织腹腔注射的方法可成功建立EM小鼠模型（成模率达100%）。荧光穿透性较差,小动物活体成像对皮下内异灶标记敏感,对腹盆腔深部病灶的观察仍需剖腹后再行拍摄。普通模型组和EGFP模型组两组小鼠建模情况比较,无统计学差异（P>0.05）,故后续实验采用普通模型组的EM小鼠作为实验研究对象。2、EM模型小鼠的妊娠率明显下降（P<0.05）,动情间期模型组不孕鼠血清中FSH、PRL水平发生异常改变（P<0.01）,LH、CA125水平未见明显变化（P>0.05）,腹腔液中IL-2水平显著升高（P<0.01）。EM模型小鼠动情周期规律,模型组小鼠无论妊娠与否,其内异灶个数、体积、粘连评分的比较均无统计学意义（P>0.05）。组织形态学观察显示模型组小鼠的卵巢颗粒细胞间有较多炎性细胞浸润;与假手术组比较,模型组小鼠始基卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡构成比明显下降,闭锁卵泡构成比显著升高（P<0.01）。3、内异方组小鼠的妊娠率明显提高（P<0.05）。内异方组小鼠内异灶个数减少、体积缩小,粘连评分降低（P<0.01）。卵巢组织形态学观察显示内异方组始基卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡构成比高于模型组、孕三烯酮组,闭锁卵泡构成比低于模型组和孕三烯酮组。在改善EM模型小鼠卵巢各级卵泡构成比方面,内异方优于孕三烯酮（P<0.05）,孕三烯酮并不能改善EM小鼠各级卵泡构成比（P>0.05）。模型组小鼠腹腔液中IL-2、IL-6水平均发生异常升高（P<0.01）,IL-10水平发生明显降低（P<0.05）。药物干预作用下内异方组和孕三烯酮组小鼠的腹腔液中IL-2、IL-6水平均显著下降,孕三烯酮组小鼠的腹腔液中IL-10水平明显升高,有统计学意义。孕三烯酮组小鼠妊娠率未能改善,且药物处理后体重、肝脏湿重、肾脏湿重均减轻。与孕三烯酮相比,内异方药物毒副性极小,未见肝脾肾损害。结论1、用模拟经期内膜组织成功地建立了EM小鼠模型。2、EM模型小鼠的生殖能力明显下降。EM模型小鼠卵巢功能受损,各级卵泡发育受到影响,盆腔微环境发生改变,盆腔粘连形成,这些均可能是造成EM小鼠生殖能力低下的重要病机。3、内异方通过抑制内异灶的生长,减少盆腔粘连,改善盆腔微环境,改善各级卵泡发育,提高了EM小鼠的生殖能力,且无毒副作用,安全性好。