非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最为常见的慢性肝脏疾病,近年来,随着生活水平的提高,饮食习惯及生活方式的改变,NAFLD的发病率也逐年上升,现已影响全球四分之一的人类健康。若不加以治疗,NAFLD会发展为严重的肝脏损坏,其中25%的患者会发展为肝纤维化,1.5%-8%发展为肝硬化,少数甚至发展为肝癌。同时NAFLD诱发的动脉粥样硬化、高血压、糖尿病以及心脑血管疾病等都是导致患者死亡的危险因素。然而目前仍然没有FDA批准的用于治疗NAFLD的有效药物,因此,进一步深入研究NAFLD发病机理,寻找有效治疗手段迫在眉睫。目前比较公认的多重打击学说认为,NAFLD是由脂代谢紊乱、神经内分泌系统失衡、慢性炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗及肠道屏障作用失调等多因素参与的慢性肝病,其中异常的脂肪酸代谢引发的肝细胞中TG的过度积累是NALFD发生的使动因素。肥胖、Ⅱ型糖尿病等因素诱发脂肪酸合成、摄取及利用的紊乱,促进NAFLD的发生发展。一方面,肥胖、Ⅱ型糖尿病可能通过诱发的胰岛素抵抗(IR),进而增强外周脂肪分解、提高血液中游离脂肪酸(FFA)水平,最终增加肝细胞的脂肪酸摄取以及TG合成;另一方面,肝脏的线粒体氧化超载导致肝脏的脂肪酸β氧化能力下降,进一步增加了肝脏中的脂质储积,与此同时,血液中FFA的增加会进一步增强IR,促进脂代谢紊乱的恶性循环。目前研究发现,脂肪酸感应分子在机体脂质代谢调控中发挥重要作用,而且也具有潜在的临床应用价值。脂肪酸感应分子PPARα参与调控脂肪酸摄取、转运、β-氧化及从头合成等多种脂代谢过程,其激动剂贝特类药物在原发性及混合性高脂血症中有了较好的临床应用;A-FABP抑制剂BMS309403可以明显改善小鼠的动脉粥样硬化及糖尿病情况,FFA4激动剂CpdA、PAHSA等也能够明显抑制小鼠糖尿病进程,都有望进入临床应用。因此,寻找参与调控肝细胞脂质代谢的脂肪酸感应分子将会为NAFLD的治疗提供新思路。TIPE(TNFα-inducedprotein8)家族是近年发现的具有潜在脂质结合能力的蛋白家族,包含TIPE、TIPE1、TIPE2、TIPE3四个成员,各成员间具有较高的序列同源性,在细胞增殖、凋亡、免疫调控及肿瘤发生发展中发挥重要调控作用。随着对TIPE家族研究的逐渐深入,人的TIPE2、TIPE3及鼠的TIPE晶体结构都已成功解析,它们均具有6个α螺旋形成的TH结构域,构成中央疏水空腔,并富含高度保守的疏水氨基酸,为疏水性脂质分子提供结合位点。研究报道TIPE2、TIPE3能够识别并转运PIP2、PIP3等磷脂分子并参与磷脂信号通路的调控,而且其与磷脂的结合方式也有了明确的解析。TIPE1的结构虽然没有文献报道,但是软件预测发现TIPE1也具有中央疏水空腔,存在结合脂质分子的潜能。TIPE1是TIPE家族的一员,目前研究发现TIPE1具有明显的抑癌作用。课题组前期研究发现,TIPE1可以通过负调控Rac1通路促进肝癌细胞凋亡,同时也有文献报道TIPE1对肺癌、胃癌的生长和转移也有明显抑制效果。TIPE1也可通过抑制FBXW5依赖的TSC2蛋白降解参与帕金森病的发生;同时TIPE1能够诱导产生大量ROS加速动脉粥样硬化的生成。我们实验室前期研究发现,HFD诱导的NAFLD模型鼠中TIPE1蛋白水平降低,提示TIPE1可能参与NAFLD的发生发展,同时文献查阅及软件预测推测TIPE1具有潜在的脂质结合能力,因此做出假设:TIPE1能够感应脂肪酸,参与NAFLD的发生发展进程。研究目的:1.研究TIPE1对肝细胞脂肪变和NAFLD发生发展的影响。2.探究TIPE1调控肝细胞脂肪变性的分子机制。(1)探讨脂肪酸结合能力在TIPE1调控肝细胞脂代谢中的作用。(2)探索参与TIPE1调控肝细胞脂肪变性的信号通路。研究方法与结果:1.TIPE1能够调控肝细胞脂代谢、抑制肝细胞脂肪变性1.1 TIPE1降低肝细胞内脂质水平首先,为初步检测TIPE1在肝细胞脂质调控中的作用,我们在HUH7细胞系中转染siTIPE1及对照siNC后进行了脂质组学检测。结果显示:干扰TIPE1后,HUH7细胞中甘油三酯(TG)、磷脂酰胆碱(PC)、神经酰胺(Cer)的水平均显著增加,提示TIPE1能够调控肝细胞内的脂质代谢。1.2体外实验证实TIPE1抑制肝细胞脂质沉积为进一步明确TIPE1在肝细胞脂肪变性中的作用,我们在肝癌HUH7细胞系中转染siTIPE1和阴性对照siNC,分别加入油酸OA或棕榈酸PA刺激24h,油红O(ORO)及BODIPY染色结果均显示:与对照组相比,siTIPE1组胞内脂沉积明显加重。相反地,HUH7细胞系过表达pcDNA3.0-TIPE1-HA后施加OA/PA刺激,细胞脂沉积明显减轻。上述实验初步证实,TIPE1可以改善肝细胞脂肪变性。1.3 TIPE1调控肝细胞脂代谢相关基因的表达NAFLD是脂质代谢紊乱引发的慢性肝脏疾病,肝细胞中脂代谢途径异常会导致脂质的过度积累,是诱发NAFLD的始动因素。我们检测了四种重要的脂代谢基因 FASN、SREBP1、PPARr、CD36 的表达。qRT-PCR 和 Western Blot 结果显示,siRNA干扰HUH7细胞系中TIPE1的表达,可显著升高FASN、SREBP1、PPARr、CD36的表达;相一致地,在HUH7细胞系中过表达TIPE1后,FASN、SREBP1、PPARr、CD36的mRNA及蛋白水平均明显降低,提示TIPE1可能通过调控脂代谢基因的表达影响肝细胞脂肪变性。2.TIPE1可以减缓NAFLD进程体外实验已证实TIPE1能够调控肝细胞脂代谢并抑制肝细胞脂肪变性,为进一步探讨TIPE1在NAFLD进程中的作用,我们构建了肝特异性过表达及敲除TIPE1的小鼠,进行高脂饮食诱导NAFLD小鼠模型,同时也在临床脂肪肝标本中进行了验证。2.1肝细胞特异性过表达TIPE1可以明显抑制NAFLD进程尾静脉高压注射 AAV-TBG-mTIPE1-Luciferase 及对照 AAV-TBG-Luciferase腺相关病毒后的14天开始高脂喂食建模3个月。活体成像结果显示:病毒特异性表达于肝脏,且TIPE1过表达效果良好;大体观察显示,mTIPE1组小鼠肝脏脂肪变有明显改善,HE、ORO染色也显示肝脏脂肪变性的明显减轻;血清TG明显降低,CHO、ALT也存在下降趋势;肝匀浆TG、CHO也下降的趋势;肝脏炎性因子IL-6、IL-1 β、TNF-α的水平降低;脂代谢相关蛋白FASN、SREBP1、CD36水平显著降低。以上结果均初步证实TIPE1可以明显改善NAFLD。2.2肝特异性敲除TIPE1可以明显促进NAFLD进程CRE-LOXP系统构建肝特异性敲除TIPE1小鼠(Alb-cre+;TIPE1 flox/flox)及对照TIPE1 flox/flox小鼠,高脂喂食5个月构建NAFLD模型。结果显示,TIPE1-KO组小鼠体重偏高,血清TG和CHO显著升高,血清游离脂肪酸FFA有升高趋势,肝脏明显变大且肝脏中脂代谢相关基因SREBP1、PPARγ、CD36的表达明显升高。证实TIPE1的确可以改善小鼠的NAFLD。2.3 NAFLD患者肝脏TIPE1表达显著降低为进一步验证TIPE1在脂肪肝中的作用,收集临床脂肪肝患者肝组织和正常肝脏组织切片,免疫组化检测TIPE1表达,结果显示脂肪肝患者的肝脏TIPE1表达显著低于正常肝脏,再次证实TIPE1可能参与脂肪肝的发生发展进程。3.TIPE1能够通过感应脂肪酸参与肝细胞脂代谢调控脂肪酸感应分子在机体脂代谢调控中发挥重要作用。晶体结构解析发现,TIPE家族的TIPE、TIPE2、TIPE3蛋白中均包含6个α螺旋形成的中央疏水空腔,可以结合PIP2、PIP3等磷脂分子并调控信号转导。软件预测发现,TIPE1也存在类似的疏水空腔结构,足以容纳OA、PA等脂肪酸分子,因此推测TIPE1可能通过结合并感应脂肪酸分子来发挥脂代谢调控的作用。3.1 TIPE1能够结合脂肪酸分子为确认TIPE1能否结合脂肪酸,我们利用Biacore进行SPR实验。将纯化的TIPE1蛋白包被于Biacore专用CM5芯片,将梯度稀释的脂肪酸:油酸OA、亚麻酸LA、花生四烯酸AA、二十二碳六烯酸DHA、硬脂酸SA作流动相,检测与TIPE1蛋白的结合情况。SPR结果显示:TIPE1能够特异性结合OA、LA、AA、DHA等脂肪酸分子,但与SA不存在结合作用,初步证实TIPE1能够与脂肪酸分子发生选择性结合。3.2 TIPE1调控肝细胞脂代谢依赖于其脂肪酸结合能力3.2.1脂肪酸可以增强TIPE1调控肝细胞脂代谢的能力为进一步明确脂肪酸结合能力在TIPE1调控肝细胞脂代谢中的作用,我们采用碳吸附血清配制培养基(不含脂肪酸)作为对照组,外加油酸钠刺激作为实验组。HUH7细胞系转染siTIPE1或对照siNC,分别设置对照组和实验组,Western blot检测脂代谢相关基因的表达。结果显示:与对照组相比,油酸钠刺激组中siTIPE1干扰后FASN、SREBP1、CD36、PPARr蛋白水平升高更加明显;相一致地,油酸钠刺激亦可增强TIPE1过表达对脂代谢基因表达的抑制作用。上述结果提示,脂肪酸可在一定程度上影响TIPE1对肝细胞脂代谢的调控作用。3.2.2候选脂肪酸结合区域的突变能够影响TIPE1对肝细胞脂代谢的调控作用为进一步确认TIPE1对肝细胞脂代谢调控是否依赖于其脂肪酸结合活性,我们根据软件预测的TIPE1蛋白结构,构建了 TIPE1突变体质粒,分别可能通过改变疏水空腔的空间位阻(L42W)、空腔处保守的正电荷氨基酸(R75/91Q、K15/16/20/24Q、K58/61/65Q)来调控TIPE1与脂肪酸的结合能力。HUH7细胞系分别过表达野生型、四种突变型TIPE1表达质粒或pcDNA3.0对照质粒,经油酸钠刺激,ORO染色和定量结果显示:与对照组相比,野生型TIPE1转染组脂质沉积减轻,而四种突变体组脂沉积程度无明显变化;Western blot结果显示:与对照组相比,野生型TIPE1转染组FASN、SREBP1、PPARr蛋白水平降低,而四种突变体组无明显变化。以上结果初步提示,TIPE1对肝细胞脂代谢调控至少部分依赖于其脂肪酸结合能力。4.mTORC1途径参与了 TIPE1感应脂肪酸、调控肝细胞脂代谢的过程已有研究报道,mTOR通路在细胞代谢中发挥重要调控作用。mTOR分子可以形成两个不同功能的复合体:mTORC1和mTORC2,其中,mTORC1可以感应生长因子、氨基酸、能量水平、氧气等调控脂质合成、蛋白质合成、自噬及溶酶体、线粒体生成等多种生命学过程。另外,有研究发现,其他TIPE家族成员具有调控mTOR通路的能力,如TIPE通过调控mTOR通路的活化抑制自噬,TIPE1是否也可能通过mTOR通路参与肝细胞脂代谢的调控呢?4.1 TIPE1能够负调控mTOR复合体的表达和活化水平首先,我们通过体内外实验检测了 TIPE1对肝细胞中mTOR复合体表达和活化的影响。HUH7细胞系转染siTIPE1及对照siNC,Western blot检测mTOR复合体及下游通路分子的表达和活化水平。结果显示:siTIPE1组中磷酸化蛋白(P-mTOR、P-RAPTOR、P-RICTOR)、总蛋白(mTOR、GβL、RAPTOR、RICTOR)及下游P-AKT、P-S6K水平均显著升高;与此同时,取肝细胞特异性过表达TIPE1或对照NAFLD模型小鼠的肝组织,Western blot检测,结果显示:TIPE1过表达的小鼠肝组织中,P-mTOR、P-RAPTOR、mTOR、RAPTOR的蛋白水平较对照组小鼠明显降低。上述结果提示,TIPE1能够负向调控mTOR复合体的表达和活化。4.2候选脂肪酸结合区域的突变影响TIPE1对mTOR复合体的调控作用前面的结果显示,TIPE1调控肝细胞脂代谢依赖于其脂肪酸结合活性,因此我们也进一步验证了该活性也在TIPE1调控mTOR复合体中具有重要的意义。HUH7细胞系分别转染野生型或潜在脂肪酸结合区域突变的TIPE1表达质粒,经油酸钠刺激,Western blot检测结果显示:尽管野生型TIPE1能够负调控mTOR、GβL蛋白的表达,而四种TIPE1突变体的作用却显著降低,初步提示TIPE1调控mTOR复合体也依赖于其脂肪酸结合活性。4.3 mTOR复合体参与TIPE1对肝细胞脂代谢的调控为进一步明确mTOR复合体是否参与TIPE1调控肝细胞脂代谢的过程,我们在HUH7细胞中转染siTIPE1或对照siNC后利用mTOR通路抑制剂雷帕霉素处理,经油酸钠刺激后,ORO染色显示:TIPE1干扰可明显加重HUH7细胞脂沉积,雷帕霉素处理后TIPE1干扰组和对照组细胞脂沉积均减弱,且两组间无明显差异;Western blot检测亦显示雷帕霉素处理可消除TIPE1对肝细胞脂代谢基因表达的影响。在转染pcDNA3.0-TIPE1-HA或pcDNA3.0的HUH7细胞中,雷帕霉素预处理亦可以明显削弱TIPE1过表达对脂代谢基因表达的抑制作用。上述结果提示,mTOR复合体参与了 TIPE1对肝细胞脂代谢的调控作用。4.4 mTORC1通路介导TIPE1对肝细胞脂代谢的调控为明确mTORC1还是mTORC2参与了 TIPE1对肝细胞脂代谢调控过程,我们分别利用RAPTOR或RICTOR小干扰敲减mTORC1或mTORC2复合体,Western blot检测脂代谢基因的表达,结果显示:siRAPTOR转染组的FASN、SREBP1、PPARr、CD36蛋白水平降低,而siRICTOR转染组无显著变化,提示mTORC1在肝细胞脂代谢中发挥更重要的作用。随后,在HUH7细胞系中共转染siRAPTOR和siTIPE1,western blot结果显示:与对照组相比,siTIPE1转染组FASN、SREBP1、PPARr蛋白水平升高,而共转染siRAPTOR后下降;ORO染色显示:与对照组细胞相比,siTIPE1转染组细胞脂沉积明显加重,而共转染siRAPTOR后有所减轻,上述结果提示mTORC1途径参与了 TIPE1对肝细胞脂代谢的调控。5.TIPE1能够结合mTORC1复合体并促进其通过蛋白酶体途径降解上述研究发现,TIPE1能够调控mTORC1复合体的表达和活化、进而抑制肝细胞脂肪变性。为进一步探讨TIPE1调控mTORC1的分子机制,我们分别从转录及蛋白降解两个方面进行了探究。5.1 TIPE1不影响mTORC1分子的转录HUH7细胞系转染siTIPE1及对照siNC,检测mTORC1复合体mRNA水平的变化。qRT-PCR结果显示:siTIPE1组中mTOR、GβL、RAPTOR的mRNA水平并无明显变化,提示TIPE1不会影响mTORC1复合体的转录。5.2 TIPE1促进mTORC1复合体通过蛋白酶体途径降解5.2.1 TIPE1促进mTORC1复合体的降解HUH7细胞系转染pcDNA3.0-TIPE1-HA及对照pcDNA3.0质粒,分别用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理0h、12h、24h、36h,Western blot检测mTORC1复合体蛋白的表达。结果显示:TIPE1组中mTOR、GβL、RAPTOR的降解明显加快,提示TIPE1可以促进mTORC1复合体的降解。自噬系统和蛋白酶体系统是真核细胞中两种主要的蛋白质降解系统,那么TIPE1通过何种途径促进mTORC1复合体的降解呢?5.2.2 TIPE1不通过自噬途径调节mTORC1降解HUH7细胞系转染siTIPE1及对照siNC,Western blot检测自噬相关蛋白变化。结果显示:siTIPE1转染组P62、LC3B的蛋白水平没有显著变化,,提示TIPE1不影响自噬途径。转染siTIPE1及对照siNC的HUH7细胞以放线菌酮(CHX)和自噬抑制剂氯喹CQ或1*PBS处理,Western blot检测发现:CQ处理后mTOR、GβL、RAPTOR蛋白水平均没有累积,且不影响TIPE1干扰对mTORC1复合体表达的上调作用,提示TIPE1不通过自噬途径参与mTORC1复合体降解。5.2.3 TIPE1促进mTORC1通过泛素-蛋白酶体途径降解HUH7细胞系转染siTIPE1及对照siNC,加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和蛋白酶体抑制剂MG132或DMSO处理,Western blot检测发现:MG132处理后mTOR、GβL、RAPTOR蛋白水平均有明显累积,而且TIPE1干扰组和对照组之间的蛋白水平间无明显差异,提示TIPE1通过调控蛋白酶体途径促进mTORC1复合体的降解。同时以HEK-293细胞系转染Ub-HA及pcDNA3.0-TIPE1-HA或pcDNA3.0对照质粒,放线菌酮CHX和MG 132处理后,CO-IP检测RAPTOR泛素化修饰水平。结果发现,TIPE1过表达明显上调了RAPTOR的泛素化修饰,提示TIPE1可能通过泛素蛋白酶体途径促进mTORC1复合体的降解。5.3 TIPE1能够与mTORC1复合体相互作用文献报道显示,TIPE1可与多种分子相互作用,调控信号转导、影响细胞生物学功能。因此,我们利用免疫共沉淀实验,检测了 TIPE1与mTORC1复合体的相互作用。HEK-293细胞系过表达pcDNA3.0-TIPE1-HA及对照pcDNA3.0质粒,用HA抗体进行CO-IP,结果显示:TIPE1与mTORC1复合体(mTOR、GβL、RAPTOR)均存在相互作用。5.4潜在脂肪酸结合区域突变削弱了 TIPE1与mTORC1的结合前面的研究结果显示,TIPE1下调mTORC1复合体的表达依赖于其脂肪酸结合能力,因此我们进一步检测了四种潜在脂肪酸结合区域突变的TIPE1蛋白与mTORC1复合体的结合情况。HEK-293细胞系过表达野生型或突变型TIPE1质粒,CO-IP结果显示:与野生型TIPE1转染组相比,除R75/91Q外,其余三种突变体与mTOR、GβL、RAPTOR的结合能力均显著下降,提示TIPE1与mTORC1复合体的结合也至少部分依赖于其脂肪酸结合活性。研究结论与意义1.基于实验室前期工作,进一步证实TIPE1能够负调控肝细胞脂代谢并改善NAFLD。2.发现TIPE1具有潜在的脂肪酸结合能力,通过感应脂肪酸参与调控肝细胞脂代谢。3.初步阐明TIPE1感应脂肪酸、促进mTORC1复合体通过蛋白酶体途径的降解,进而介导其对肝细胞脂代谢的负调控作用。创新性及研究意义本文发现了 TIPE1具有脂肪酸结合能力,通过感应脂肪酸、调控mTORC1的表达和活化、抑制肝细胞脂质沉积和改善NAFLD疾病进程,为阐明NAFLD发病机制和临床治疗提供了新思路。