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布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）和表皮生长因子受体（EGFR）具有相同的保守的半胱氨酸结合位点,多种BTK抑制剂和克服T790M耐药突变的EGFR抑制剂均为共价抑制剂,通常这二者的抑制剂对BTK或EGFR都具有抑制活性。本论文围绕BTK和EGFR这两个靶点,开展新型抑制剂的筛选和活性研究。第一部分新型BTK抑制剂的筛选及抗肿瘤活性评价BTK是B细胞受体（BCR）信号通路中重要的下游信号分子,在B淋巴细胞中均有表达。BTK调控B细胞的增殖、分化和凋亡,是目前临床研究治疗B细胞相关肿瘤及免疫疾病的重要靶点。目前已有两个靶向BTK的小分子抑制剂上市,其中,ibrutinib是BTK一代抑制剂,为共价抑制剂,于2013年11月上市用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）及华氏巨球蛋白血症（WM）,但由于其脱靶效应,毒副作用较大,因此,高选择性的BTK抑制剂的研发受到广泛关注。Acalabrutinib（ACP-196）于2017年11月上市,同样属于共价抑制剂,由于其选择性较高,被认为是BTK二代抑制剂,用于CLL和MCL的治疗,但该抑制剂在临床治疗中存在头痛、腹泻和体重增加等副作用。因此开发高效、低毒的高选择性BTK抑制剂具有重要的临床意义。本课题组通过与化学家合作,设计、合成具有嘧啶并[4,5-d][1,3]恶嗪-2-酮母核结构的BTK抑制剂化合物1-8。ELISA检测结果表明化合物1和2对BTK的激酶抑制活性最强,IC50分别为4.7 nM和7.0 nM,弱于已上市的BTK一代抑制剂ibrutinib(IC50=0.6 nM),优于BTK二代抑制剂ACP-196(IC50=8.6 nM)。接下来采用分子对接模拟化合物与激酶作用方式,结果显示化合物1或2的亲电丙烯酰胺基团能与BTK激酶区的Cys481位点形成稳定的共价键,增强两者间的亲和性,进而抑制BTK激酶的活性。综合化合物结构特点与理化性质,我们选取化合物2开展进一步研究。激酶谱检测结果表明,化合物2在1000 nM浓度下对BTK激酶的抑制活性与阳性药相当或更强,同时,其对其他激酶的抑制活性较弱,选择性优于ibrutinib,与ACP-196相当。细胞水平检测结果显示,化合物2可剂量依赖性地抑制Ramos和TMD8两株B细胞淋巴瘤细胞中BTK的磷酸化,并有效抑制细胞的体外增殖,IC50分别为15.07μM和0.03μM,活性与ibrutinib和ACP-196相当或更强。进而,流式细胞技术检测结果显示,化合物2可剂量依赖性地诱导TMD8细胞发生G1期阻滞,并抑制周期阻滞蛋白p-Rb、Rb、cyclin D1的表达;此外,化合物2还可诱导TMD8细胞发生凋亡,促进凋亡相关蛋白PARP、caspase 3的切割。以上工作表明化合物2为高活性、高选择性的新结构BTK共价抑制剂,值得深入研究,并值得再此基础上进一步改造和优化,以期开发出具有我国自主知识产权的高效低毒的新型BTK抑制剂,为B细胞淋巴瘤的治疗提供有效策略。第二部分,靶向EGFR C797S的四代抑制剂的筛选及活性评价EGFR是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的重要靶点,已有gefitinib,erlotinib等一代抑制剂被批准用于治疗含EGFR敏感突变（exon 19Del,L858R）的NSCLC。但是,耐药问题严重限制其使用。由于EGFR T790M耐药突变是EGFR一代抑制剂耐药的最常见原因,因此,选择性抑制EGFR T790M耐药突变,而对野生型EGFR（EGFR WT）抑制活性较弱的三代抑制剂倍受关注。其中AstraZeneca公司研发的化合物AZD9291（osimertinib,Tagrisso）已于2015年11月被FDA批准上市用于治疗转移性含EGFR T790M的NSCLC,并取得了较好的临床效果。然而,耐药仍然是NSCLC靶向治疗长期临床获益的主要障碍。EGFR C797S突变被确证为EGFR三代抑制剂耐药的主要原因之一（22-24%）,靶向EGFR C797S突变的EGFR四代抑制剂也成为了新的临床需求。目前报道的四代抑制剂包括变构抑制剂EAI045和ALK/EGFR双靶抑制剂brigatinib等,但它们单用疗效不佳,需与EGFR抗体联用才能克服该耐药突变,且目前尚无EGFR四代抑制剂进入临床研究,因此,研发具有我国自主知识产权的EGFR四代抑制剂具有重要的意义。本课题组在已有的四代抑制剂筛选平台的基础上,通过与化学家合作,设计、合成了新型EGFR四代抑制剂共122个。采用ELISA方法,对这些化合物进行了分子水平的EGFR C797S抑制活性的初步筛选,得到活性化合物79个(IC50<100 nM)其中高活性化合物29个(IC50<10 nM)。在这些高活性化合物中,HCD210、HCD228、HCD229、HCD230、HCD233、HCD235、HCD239、HCD244、LS 2-145、LS 3-16和LS 3-19对EGFR WT激酶抑制活性较弱,具有良好的选择性。进一步对这些化合物进行细胞水平活性检测,结果表明,化合物HCD210、HCD228、HCD233和HCD235可抑制高表达EGFR C797S三突变的BaF3工具细胞（BaF3-EGFR L858R/T790M/C797S和BaF3-EGFR 19D/T790M/C797S）中靶点EGFR的活化,并有效抑制细胞的体外增殖。以上工作表明,化合物HCD210、HCD228、HCD233和HCD235具有良好的EGFR C797S抑制活性及体外抗EGFR C797S肿瘤活性,是潜在的新结构EGFR四代抑制剂,值得在此基础上进行改造和优化并在体内模型上开展抗肿瘤活性研究,同时其他新结构抑制剂的活性筛选仍在进行中。本课题的开展有望开发出具有我国自主知识产权的EGFR四代抑制剂候选新药,为治疗EGFR C797S突变的NSCLC提供有效策略,也为同类抑制剂的研发与应用提供参考依据。