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研究目的:RUNX1为RUNX家族成员之一,参与细胞谱系特异性基因、细胞分化和发育过程中多种功能的调节,早期研究主要集中与血液系统疾病,越来越多研究发现RUNX1在多种实体肿瘤中发挥促进肿瘤恶性进展或抑制肿瘤增殖的作用,在胰腺癌中RUNX1可促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)增强肿瘤侵袭迁移,然而RUNX1与胰腺癌化疗耐药的相关性尚无研究报道。在前期对TCGA数据的分析研究中我们发现RUNX1表达与胰腺癌治疗疗效可能存在一定关联,因此本课题设计旨在明确RUNX1与胰腺癌吉西他滨耐药的相关性,并探讨其中的分子机制,同时评估RUNX1在胰腺癌中的治疗价值以及化疗疗效预测价值。研究方法:免疫组化检测组织中的蛋白表达;CCK8检测细胞的活力;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相关基因的mRNA水平;Western blot检测相关指标的蛋白水平;透射电镜观察细胞内质网结构;脂质体转染建立瞬时表达或敲低细胞株;分子克隆及病毒感染构建稳定表达细胞系;染色质免疫共沉淀技术(chromatin-immunoprecipitation,ChIP)检测蛋白与DNA的结合;双荧光素酶报告基因体系检测蛋白与DNA序列结合后的转录活性;动物皮下成瘤检测目的基因对肿瘤生长的作用以及对药物反应的影响。结果:1.临床资料分析显示RUNX1蛋白表达是胰腺癌预后不良的因素。RUNX1高表达组患者较低表达组T分期更晚,组织分化程度低,淋巴结转移发生率高。Kaplan-Meier生存分析显示RUNX1低表达组患者生存较高表达组明显延长。2.TCGA数据库分析提示RUNX1表达与胰腺癌患者后期治疗疗效有关,胰腺癌患者完全缓解组中RUNX1的表达显著低于病情进展组,进一步分析发现在病情进展组中RUNX1高表达者中位生存期短。在体外试验中,RUNX1过表达的胰腺癌细胞在吉西他滨处理环境下细胞活力率较对照组增强,细胞凋亡比例减少。反之,当RUNX1表达下降后,胰腺癌细胞在吉西他滨环境下存活率明显下降,细胞凋亡比例增加。同样,当吉西他滨耐药细胞株中RUNX1的表达下调后,细胞毒性试验提示RUNX1表达下降可逆转耐药株对吉西他滨的敏感性。3.RUNX1通过内质网应激通路诱导耐药发生。电镜下发现胰腺癌细胞在吉西他滨作用后24 h,细胞核周围正常的排列规则的呈扁平囊状的内质网结构发生大量囊泡样改变,排列不规整。内质网应激阻断实验显示阻断内质网应激后可逆转RUNX1对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响。当RUNX1表达上调时,BiP及UPR通路关键分子如eIF2α蛋白磷酸化水平随之升高,反之则下降。4.RUNX1通过BiP调控内质网应激应答。利用TCGA数据库分析显示RUNX1与BiP(HSPA5)的表达呈正相关(R=0.32,P<0.001)。qPCR、Western blot及免疫组化检测BiP的表达水平与RUNX1的表达呈正相关。ChIP技术检测RUNX1可与BiP启动子区相应序列结合。双荧光素酶试验显示RUNX1可转录激活BiP的表达。5.在胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型中,吉西他滨单药组、Ro5-3335单药组及两药联合组肿瘤大小、肿瘤重量与对照组相比有显著差异,三组的肿瘤体积及瘤体重量均显著小于对照组;两药联合组吉西他滨抑瘤率高于吉西他滨单药组。裸鼠成瘤后各组体重呈不同程度下降,以吉西他滨单药或联合Ro5-3335给药组消瘦最明显,体重显著低于对照组及Ro5-3335单药组,而对照组及Ro5-3335单药组之间无差异。此外当RUNX1表达下调时,肿瘤增长速度明显减慢,吉西他滨对移植瘤的抑制作用更明显,恢复RUNX1表达后肿瘤生长速度显著加快。结论:1.RUNX1可作为胰腺导管腺癌患者的预后不良的预测指标。2.RUNX1可降低胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。3.RUNX1可增强内质网应激应答能力,并通过内质网应激途径导致了细胞对吉西他滨敏感性降低。4.RUNX1可直接激活BiP转录翻译,并通过BiP增强细胞内质网应激应答能力。5.RUNX1抑制剂在动物体内具有抑制胰腺癌生长的作用,且RUNX1抑制剂组的动物耐受性好。RUNX1抑制剂联合吉西他滨较吉西他滨单药能增加对肿瘤抑制作用。