【摘 要】
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目的:本研究的主要目的是寻找人脑组织cDNA文库中与hPER1蛋白相互作用的新蛋白,完善Per1相关的近日节律钟控系统的详细机制和信号传导通路。研究分为三个部分:1、人脑组织中
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目的:本研究的主要目的是寻找人脑组织cDNA文库中与hPER1蛋白相互作用的新蛋白,完善Per1相关的近日节律钟控系统的详细机制和信号传导通路。研究分为三个部分:1、人脑组织中与hPER1相互作用新蛋白的筛选与鉴定;2、新蛋白与hPER1相互作用的关键结构域的确定;3、新蛋白与hPER1的功能联系的研究。方法与结果:第一部分:人脑cDNA文库中与hPER1相互作用蛋白的筛选方法:采用BD Clontech公司提供的文库构建试剂盒(BD Matchmaker? Library Construction & Screening Kits)构建人脑cDNA文库。通过RT-PCR扩增hPER1-PAS结构域的编码序列,获得的片断与质粒载体pGBKT7连接重组为诱饵质粒pGBKT7/hPer1PAS。采用顺序转染法构建酵母双杂交系统(MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System,BD Clontech),筛选人脑cDNA文库中能与诱饵蛋白hPER1-PAS结构域相互作用的蛋白。并且采用营养缺陷培养基、β-半乳糖苷酶印膜法检测报告基因的表达;免疫共沉淀实验确证蛋白间的相互作用。阳性克隆子经PCR扩增,进行测序和比对分析。结果:成功构建以pGBKT7/hPer1PAS为诱饵蛋白的表达质粒;构建人脑cDNA文库;成功构建pGBKT7/hPer1PAS和pGADT7-Rec/cDNA的酵母双杂交系统,并经过营养缺陷筛选、β-半乳糖苷酶印膜法检测以及免疫共沉淀实验,总共筛选到
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