胃癌是世界上第二位高发、高致死率恶性肿瘤,也是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的发生发展是多个因素共同作用的结果,也是一个相当漫长的演变阶段,可能与多种外部因素相关,在此作用下,个体遗传素质改变,包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、端粒酶的激活、细胞骨架和黏附分子的改变、生长因子及其受体改变、DNA修复基因的异常和积累等,最后细胞异常增生,肿瘤形成并发生转移。胃癌还与慢性胃炎、胃息肉、胃粘膜异形增生和肠上皮化生等有一定关系。　　 随着分子生物学技术的发展,人们对胃癌发病机制的研究已经深入到分子水平,从中找出有价值的胃癌诊断标记物和治疗靶分子是目前胃癌研究的重点和热点。　　 法尼酯衍生物X受体(FXR)是一种主要在肝及胃肠系统等组织器官表达的胆汁酸受体,属于激素核受体超家族的一员,在胆汁酸代谢及胆固醇代谢中发挥重要作用。　　 但FXR的作用远不止于代谢调节。总结目前关于FXR的研究,提示,FXR在胆汁淤积、肝肿瘤、消化道肿瘤等均有保护作用,但其分子机制究竟为何,尚未有深入研究。本研究拟针对FXR在胃癌中的作用机进行初步探讨,为FXR和胃癌的相互关系提供证据。　　 第一章FXR在人正常胃、胃癌组织及人胃癌细胞株中的表达目的检测FXR在正常胃/胃癌组织,及多种胃癌细胞株中的表达情况。　　 方法　　 1.收集德国慕尼黑工业大学伊萨河右岸医院(Klinikum rechts der Isar der TUM)2002年～2008年住院部及门诊病例,人正常胃/胃癌组织标本,应用qPCR、westernblot、免疫组化方法检测FXR在人正常胃/胃癌组织的表达模式。　　 2.用qPCR和westernblot方法检测人胃癌细胞株AGS、N87、Snu-1、Snu-5、KATO-Ⅲ、MKN7、MKN45中FXR的表达。　　 结果　　 1.FXR表达于人正常胃粘膜上皮,而在胃癌上皮中明显下调或缺失。　　 由免疫组化染色可见FXR主要位于非肿瘤性胃腺上皮,核染色为主,还有部分阳性染色位于腺体周围结缔组织。对于胃癌组织,FXR阳性染色明显减弱,且胞浆染色为主。　　 选取30例胃癌患者及相应正常胃粘膜组织,qPCR分析显示83.5％(25/30)患者mRNA水平在正常胃粘膜处于较高水平,胃癌组织中下调,具有显著性差异。　　 Westernblot分析可见FXR为一分子量为56kD蛋白,正常组织可见清晰强阳性条带,肿瘤组织弱阳性或表达缺失。　　 2.FXR在绝大部分胃癌细胞株中缺失。　　 qPCR分析显示:胃癌细胞株AGS、Snul、Snu5、N87、KATO3、MKN7、MKN45中FXR的表达缺失,HepG2细胞作为阳性对照呈高表达。　　 Westernblot显示:FXR在所有胃癌细胞株中均缺失,肝组织作为阳性对照呈现浓黑条带。　　 结论　　 1.FXR在正常胃粘膜表达,在胃癌组织下调或缺失。　　 2.FXR在大多数人胃癌细胞株缺失。　　 第二章异源性FXR增加AGS胃癌细胞株抗TNFα介导的凋亡作用　　 目的　　 以AGS细胞为代表,建立了FXR-WT/FXR—EV/FXR-DN质粒稳定转染的AGS克隆,通过一系列细胞学检测,初步阐述FXR在AGS生物学行为上的分子机制。　　 方法　　 1.根据lipofectamineTM2000试剂盒标准方案构建稳定表达FXR—WT(FXR野生型)/FXR—EV(FXR空载质粒)/FXR—DN(FXR显性失活)的AGS克隆。　　 2.通过FXR配体鹅去氧胆酸(CDCA),及凋亡诱导剂TNFα+CHX处理AGS细胞,建立不同AGS克隆凋亡模型。　　 3.MTT法绘制TNFα+CHX诱导的凋亡曲线。　　 4.RT-qPCR鉴定FXR在AGS克隆的表达。　　 5.Westerblot鉴定FXR在AGS克隆的表达及TNFα+CHX诱导AGS克隆凋亡Caspase-8/Caspase-3/PARP的表达。　　 6.荧光倒置显微镜检测TNFα+CHX诱导凋亡的AGS细胞7.流式细胞仪检测不同AGS克隆在TNFα+CHX诱导下的凋亡。　　 8.RNA干扰结果1.成功建立FXR-WT/FXR-EV/FXR-DN稳定转染的AGS克隆细胞系,并用qPCR及westernblot检测FXR在AGS克隆的稳定表达。　　 2.MTT法检测FXR在AGS克隆的抗凋亡作用。无FXR配体CDCA共处理的凋亡诱导,随着TNFα+CHx浓度的增加,WT克隆存活率明显大于EV克隆和DN克隆。有FXR配体CDCA共处理的凋亡诱导,以不同浓度TNFα+CHX处理AGS克隆24小时,随着TNFα+CHX浓度的增加,可见WT克隆存活率明显大于EV克隆和DN克隆,且WT克隆存活率较没有CDCA共处理的WT克隆存活率更高。CDCA50uM能最大限度保护FXR—WT AGS细胞。　　 3.根据前面结果,选择TNFα100ng/ml+CHX20ug/ml这一浓度,用westernblot观察不同曝露时间下AGS克隆凋亡酶Caspase及其底物PARP的表达情况。FXR-EV/FXR-WT的凋亡产物都随处理时间增加而增加,且FXR-EV克隆凋亡产物表达量较FXR-WT明显增加。　　 4.荧光倒置显微镜检测Annexin-V-FLUOS染色的AGS FXR-WT/FXR-EV凋亡细胞。AGS克隆在用TNFα100ng/ml+CHX20ug/ml处理细胞24小时,诱导产生凋亡细胞,采用Annexin-V-FLUOS/PI双染色,并用荧光倒置显微镜镜检,确认AGS FXR—EV较AGS FXR—WT出现更多凋亡细胞。　　 5.流式细胞仪计数AGS FXR-WT/FXR-EV凋亡细胞。精确计数AGSFXR-WT/FXR—EV细胞在TNFα+CHX诱导下凋亡程度的差别,利用流式细胞仪,采取Annexin-V-FLUOS/PI双染色,计算(凋亡细胞/50000细胞)比率,发现FXR-EV细胞较FXR—WT细胞出现更多凋亡细胞,具有显著性差异。　　 6.MTT法检测siRNA干扰的AGS FXR-WT克隆凋亡情况。运用RNA干扰技术处理AGS FXR—WT克隆,沉默FXR基因,经检测,基因沉默效果较好,经过RNA干扰,FXR基因沉默的AGS FXR.WT克隆凋亡率明显高于未经过干扰的AGS FXR-WT克隆；在两者经过同样的FXR配体CDCA处理以后,CDCA在未经干扰的AGS FXR-WT克隆显示出其对凋亡的保护作用,而在FXR基因沉默的克隆未显示出相似作用。　　 结论　　 1.通过建立稳定转染FXR-WT/FXR-EV/FXR-DN的AGS克隆,可以研究0FXR在胃癌细胞株中的生物学行为。　　 2.异源性FXR在AGS胃癌细胞株中有抗TNFα+CHX诱导凋亡的作用,这一作用有可能减少炎症引起的细胞损伤,起远期抑癌作用。　　 第三章FXR的激活上调靶基因CK13的表达　　 目的　　 应用基因芯片技术筛选出可能介导FXR抗凋亡的基因CK13,并从mRNA和蛋白水平上确认了FXR激活对CK13的上调作用。检测了人正常胃/胃癌组织CK13的表达,并以胃癌细胞株AGS和FXR—KO小鼠为模型,从体内外两方面阐述了FXR对CK13基因的结合和转录调控。　　 方法　　 1.AGS克隆基因表达谱的基因芯片分析,根据Affymetrix GeneChip(R)GeneExpression Analysis Technical Manual标准方案。　　 2.RT-qPCR鉴定CK13在AGS克隆、小鼠胃组织、人正常胃/胃癌组织中的表达。　　 3.westerblot鉴定CK13在AGS克隆、小鼠各器官组织、人正常胃/胃癌组织中的表达。　　 4.CK13在FXR-WT/FXR-KO小鼠胃组织的免疫组化染色。　　 5.ChIP,根据ChIP Assay Kit(Upstate)标准方案。　　 6.EMSA　　 结果　　 1.基因芯片表达谱分析及挑选介导FXR激活抗凋亡作用的候选基因以CDCA100uM/DMSO处理AGS FXR—WT/FXR-EV16小时后,根据基因芯片分析结果挑选出FXR候选靶基因CK13。　　 2.FXR激活诱导CK13表达上调2.1基因芯片FXR依赖基因表达谱变化的qPCR分析作为FXR的经典靶基因OSTalpha和IBABP,经FXR配体CDCA刺激后,AGS FXR-WT都有不同程度的上调,而AGS FXR—EV/AGS FXR—DN则基本没有变化,HepG2是阳性对照。由此可确知FXR依赖性的CDCA的配体激活作用。经qPCR检测,CDCA诱导AGS FXR—WT中CK13的上调与基因芯片的结果吻合。　　 2.2 CDCA通过FXR上调AGS FXR-WT细胞CK13表达是浓度依赖性CDCA处理AGS克隆24d小时,浓度分别为0,25,50,75,100uM。经qPCR检测,AGS FXR—WT细胞呈现明显的CK13 mRNA上调,呈CDCA浓度依赖性,而AGS FXR-EV/FXR-DN细胞无明显变化。经westernblot检测,AGS FXR-WT细胞呈现明显的CK13蛋白上调,呈CDCA浓度依赖性,而AGS FXR-EV/FXR-DN细胞无明显变化。　　 2.3 CDCA通过FXR在小鼠胃组织上调CK13 mRNA表达为进一步探讨CDCA通过FXR诱导的CK13在体内的表达模式,用含有(1％CDCA+Zn)的饲料喂养C57BU6野生型(n=5)和FXR-KO小鼠(n=5)7天及8周,提取其胃组织mRNA,经qPCR检测,发现CK13 mRNA在C57BL/6野生型表达上调,短期(7天)或长期(8周)有相似反应,短期反应更显著,但在FXR-KO小鼠基本没有改变。除此之外,对小鼠其他器官如肝、食管和结肠FXR经典靶基因的qPCR检测(SHP、Cyp7A、IBABP等)显示,Cyp7A在肝外器官低表达,且对CDCA刺激无反应；但IBABP在C57BL/6野生型小鼠结肠、食管和胃的表达显著性上调,在FXR-KO小鼠无改变,显示出CDCA可以引发系统性的肝外的FXR依赖反应。　　 3.CK13在C57BL/6野生型和FXR-KOd,鼠器官的表达模式为了观察CK13在小鼠其他器官的表达模式是否与FXR相关,我们检测了C57BL/6野生型和FXR-KO小鼠不同器官的CK13 mRNA和蛋白水平。CK13在C57BL/6野生型小鼠各器官均有表达,在FXR-KOd小鼠低表达或缺失。免疫组化染色显示胃腺和胃食管连接处鳞状上皮的CK13阳性染色。CK13主要表达于胃上皮细胞周围的纤维母细胞,提示其作为细胞骨架蛋白,在细胞连接、稳定的作用。　　 4.CK13在人正常胃/胃癌组织中的表达在确认胃癌细胞株和FXR-KO小鼠CK13下调以后,接下来的实验检测了CK13在人正常胃/胃癌组织中的表达。并在mRNA、蛋白水平阐明,CK13与FXR的变化模式一致,表达于正常胃黏膜上皮,在胃癌组织中下调或缺失。　　 qPCR结果显示:CK13 mRNA在胃癌组织下调,与正常胃黏膜相比有显著性差异,在30病例中,80％(24/30)符合上述模式。　　 westernblot检测:从代表性病例中可见,CK-13蛋白表达与m RNA的趋势一致,在人正常胃组织中高表达,在胃癌组织下调或缺失。　　 免疫组化显示:CK13典型阳性染色为细胞内网状结构,因其为细胞内的中等纤维,故在呈现为细胞骨架。在弥漫性胃癌组织内,CK13阳性染色减弱。值得一提的是,在肠上皮化生的示范染色中,可见残留正常腺体CK13染色阳性,而在化生病灶中,CK13染色阴性,充分说明在正常至癌变的过渡中,CK13趋向于下调。　　 5.CK13的定量ChIP在本实验中,应用FXR多抗(H-130,Santa Cruz Biotech)作为抗体,CK13的DNA纯化片段用qPCR扩增,CT值用b2m标化,直接比较AGS FXR—WT/FXR—EV的免疫沉淀产物。qPCR产物并用琼脂糖电泳显示。AGS FXR-WT克隆CK13基础表达量较AGS FXR—EV克隆CK13基础表达量高,且经过FXR配体CDCA刺激后,AGS FXR-WT克隆CK13表达量明显上调,而AGS FXR—EV克隆无明显变化。　　 6.荧光素酶活性检测我们将含有CK13启动子的报道基因CK13 promoter pGL3-basic—luciferasevector或FXR-RE pTK-luc和FXR—WT或EV共转染入HEK293细胞,并用50μM和100μM CDCA处理24小时后观察荧光素酶活性的变化。CDCA处理FXR-WT转染的HEK293细胞后引起CK13启动子pGL3-luc的荧光素酶活性明显升高,而EV转染的HEK293细胞在CDCA处理后报道基因荧光素酶的表达未见明显变化,作为阳性对照,FXR-REpTK-luc转染的HEK293细胞内的荧光素酶活性在FXR激活后呈CDCA浓度依赖性的升高。　　 7.MTT法检测CK13 siRNA干扰的AGS FXR—WT克隆凋亡情况为进一步明确CK-13在AGS克隆凋亡中所起的作用,我们运用RNA干扰技术处理AGS FXR-WT克隆,沉默FXR基因。图3-13右侧的小图(qPCR产物琼脂糖电泳)显示RNA干扰的效能,RNAi处理的克隆CK13表达明显减弱。　　 经过CK13 RNA干扰,CK13基因沉默的AGS FXR—WT克隆凋亡率明显高于未经过干扰的AGS FXR-WT克隆；在两者经过同样的FXR配体CDCA处理以后,CDCA在未经干扰的AGS FXR-WT克隆显示出其对凋亡的保护作用,而在CK13基因沉默的克隆未显示出相似作用。　　 8.EMSA检测FXR在CK13基因上的结合位点我们应用EMSA检测FXR是否直接与CK13基因元件结合。FXR-WT质粒转染HEK293细胞后,首先应用western blotting确认了转染和核蛋白的提取的成功。经过分析,我们筛选出一些FXR在CK13基因上的可能结合位点,即VDR和RARE—1,2,3。　　 EMSA的结果显示,与未转染的HEK293细胞相比,转染了FXR-WT质粒的HEK293细胞的核蛋白对FXR IR-1寡核苷酸探针的结合明显增加,此结合被200倍过量的未标记RARE-3寡核苷酸探针显著竞争抑制,而200倍过量的未标记寡核苷酸探针RARE-3(MUT)未引起结合的显著降低。　　 结论　　 1.胃癌AGS细胞株及小鼠、人胃组织CK13基因的表达上调依赖于FXR的激活。　　 2.FXR激活可能通过CK-13抑制细胞凋亡。　　 3.FXR作为核转录因子,结合于CK13基因的RARE位点,调节CK13表达。