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我国已步入老年化社会,到2025年老年人口将超过2.8亿,占全国人口比例16%以上。股骨颈骨折的发病率随着年龄递增,60岁以上为高发人群。据有效统计,预计到2050年,全球范围内股骨颈骨折发病人数将达到600万人以上。
髋关节置换手术是矫治老年人股骨颈骨折的主要手术方式;医院面临逐渐增多的医疗压力。
接受髋关节手术的高龄患者常合并缺血性心脏病、呼吸衰竭、脑血管病后遗症等疾病,此外部分患者服用阿司匹林或其它抗血小板药物致凝血功能轻度异常,对临床麻醉提出挑战。传统观念认为:低位椎管麻醉对呼吸和循环的影响优于全身麻醉,可能更适合髋关节手术的高危人群;但2014年发表于JAMA杂志上一篇回顾性队列研究发现:与全身麻醉下的髋关节手术组相比,椎管麻醉组患者的30天死亡率没有明显下降,仅住院天数较全身麻醉组减少0.6天[1]。临床研究发现:外周神经阻滞对手术患者全身系统的影响,尤其是对心血管系统、呼吸系统的影响小于椎管麻醉和全身麻醉,麻醉后并发症也显著少于后者[2]。以上两项研究对“椎管麻醉是老年患者髋关节手术首选的麻醉方法”这一传统观念提出了挑战。
在缺血性心脏病患者行心脏手术或非心脏手术期间,选择合适麻醉药物维持麻醉的同时保护心肌细胞至关重要[3-5]。丙泊酚是常用麻醉药物,其酚类结构,在发挥强效麻醉镇静功能的同时,还能防止缺血/再灌注对组织的损伤。有学者发现丙泊酚在大鼠心肌细胞和巨噬细胞具有抗氧化作用,机制为:丙泊酚抑制氧化应激相关酶,如:诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、SOD2、p47phox,增加细胞内源性一氧化氮(nitric oxide,NO)释放[6,7],而且可以通过降低Bax的表达从而增加加B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)对细胞活性的促进效应[8]。动物实验中,丙泊酚抑制NF-κB在缺血再灌注心肌组织中的过表达,NF-κB参与心肌缺血再灌注损伤的炎性反应以及心肌细胞凋亡过程[9]。丙泊酚在新生大鼠心肌细胞培养液中可抑制依赖于线粒体,由p53触发以及PKC-δ介导的细胞凋亡信号通路,从而减轻阿霉素诱导的氧化应激和细胞凋亡[10]。丙泊酚还可部分抑制心肌的肥大细胞活化从而减轻心肌缺血再灌注损伤[11]。上述文献表明:丙泊酚通过不同的信号通路在不同的细胞中发挥着广泛的作用。然而,不同浓度丙泊酚对缺血缺氧环境下人心肌细胞的影响和机制仍不清楚。
氯化钴(Cobalt chloride,CoCl2)是由钴和氯组成的无机化合物,可引起类似缺血缺氧的病理环境,是制造低氧模型的一种经典方法,其可以使组织细胞内氧自由基过度生成,抗氧化应激的能力下降,诱发氧化应激损伤细胞[12-15]。本研究拟使用CoCl2处理的人心肌AC16细胞和HCM细胞作为心肌细胞低氧损伤的体外模型,探讨丙泊酚预处理对CoCl2诱导的低氧环境中人心肌AC16和HCM细胞的影响,并探索相关的分子机制。
第一部分筛选丙泊酚预处理浓度和CoCl2诱导人离体心肌AC16及HCM细胞低氧损伤的合适时间与浓度
研究目的:筛选丙泊酚预处理浓度和CoCl2诱导人离体心肌AC16及HCM细胞低氧损伤的合适时间与浓度。
研究方法:培养人心肌AC16细胞和HCM细胞,使用不同浓度的CoCl2(0,125,250,500和1000μM)和不同孵育时间(0,6,12,24或48h)研究其对两种心肌细胞活力的影响,依次筛选出使用CoCl2诱导人AC16和HCM心肌细胞低氧损伤体外模型的合适时间和浓度。使用不同浓度丙泊酚(0,12.5,25,50或100μg/ml)预处理AC16和HCM心肌细胞,再置入按上述实验筛选出适宜浓度CoCl2配制的完全DMEM/F12培养基,在5%CO2环境中以37℃孵育上述实验筛选出的适宜时间,研究丙泊酚预处理两种心肌细胞适宜浓度,通过CCK-8评估心肌细胞活力。此外,在同样实验条件下,将20%的中长链脂肪乳稀释至100,200,400,800或1600倍,分别预处理以上两种心肌细胞,再检测两种心肌细胞活力。
结果:随着CoCl2浓度增加(0,125,250,500和1000μM)孵育12h后,人AC16和HCM心肌细胞活力显著降低,呈浓度依赖性;与250μMCoCl2浓度组相比,于500μM和1000μMCoCl2浓度组抑制心肌细胞活力达到最大效能(P<0.01),所以选择最低有效浓度500μMCoCl2行进一步实验。随着孵育时间的延长(0,6,12,24或48h),使用500μMCoCl2诱发的低氧环境中人心肌AC16和HCM细胞活力显著降低。在使用500μMCoCl2处理12h诱导的低氧组中,AC16和HCM细胞活力分别降低到对照组中获得的值的62.30%(0.7419 /1.1909)和57.13%(0.7739 / 1.3546)(P<0.01)。随后研究显示丙泊酚以浓度依赖性方式逆转因CoCl2诱导低氧环境下AC16和HCM细胞活力的降低。本研究还观察到丙泊酚对CoCl2诱导低氧损伤的保护作用在50μg/ml浓度下最佳(P<0.01)。此外,不同浓度中长链脂肪乳在常氧条件或CoCl2诱导的低氧条件均不影响体外AC16和HCM细胞活力。
结论:CoCl2以浓度和时间依赖性方式降低体外人心肌AC16细胞和HCM细胞的活力。以500μMCoCl2处理AC16和HCM细胞12h可以建立合适的心肌缺氧损伤模型,对CoCl2诱导的低氧损伤,丙泊酚预处理保护作用在50μg/ml浓度下最佳。中长链脂肪乳不影响CoCl2诱导低氧环境下人心肌AC16细胞和HCM细胞活力。
第二部分丙泊酚预处理对CoCl2诱导人离体心肌AC16和HCM细胞低氧损伤的影响
研究目的:丙泊酚预处理对CoCl2诱导人离体心肌AC16和HCM细胞低氧损伤的影响。
研究方法:将AC16细胞分为对照组、CoCl2诱导低氧组(500μM,12h)和丙泊酚(50μg/ml,2h)+CoCl2诱导低氧组。HCM细胞同样分为以上三组。流式细胞术检测各组不同心肌细胞凋亡和线粒体膜电位;ROS敏感荧光探针(DCFH-DA)测定各组心肌细胞中ROS含量;检测各组不同心肌细胞中的总细胞MDA和SOD水平。
结果:(1)丙泊酚(50μg/ml,2h)预处理可防止CoCl2诱导的AC16细胞和HCM细胞凋亡,并显著抑制CoCl2诱导的AC16细胞和HCM细胞的线粒体膜电位下降;(2)与对照组相比,CoCl2诱导低氧组AC16细胞和HCM细胞中ROS和MDA水平升高,SOD水平显著降低(P<0.01),而丙泊酚+CoCl2诱导低氧组,CoCl2处理前2h使用50μg/ml丙泊酚预处理,两种心肌细胞上述指标均显著改善(P<0.05)。
结论:丙泊酚预处理AC16细胞和HCM细胞可显著减少细胞凋亡和线粒体膜电位下降,减轻ROS和MDA的过释放,并有效抑制CoCl2诱导两种心肌细胞的SOD降低和氧化应激反应程度。
第三部分丙泊酚预处理对CoCl2诱导人离体心肌AC16和HCM细胞低氧损伤保护机制的分子途径
研究目的:丙泊酚预处理对CoCl2诱导离体人心肌AC16和HCM细胞在低氧损伤保护机制的分子途径。
研究方法:蛋白质印迹用于评估信号传导途径的激活。将AC16和HCM细胞以不同浓度丙泊酚(0,10,25和50μg/ml)预处理2h后再用500μMCoCl2处理12h,检测MAPK(p38、ERK和JNK)信号传导通路是否激活。
结果:CoCl2可以显著促进AC16细胞中JNK和p38的磷酸化和HCM细胞中JNK的磷酸化,丙泊酚(0,10,25和50μg/ml)预处理2h后不影响离体人心肌AC16和HCM细胞中ERK磷酸化,但是可以通过丙泊酚(50μg/ml,2h)预处理显著抑制AC16细胞中JNK和p38的磷酸化(P<0.05)和HCM细胞中JNK的磷酸化(P<0.05)。
结论:丙泊酚(50μg/ml,2h)预处理可能通过调节JNK或p38信号通路保护人心肌AC16细胞和HCM细胞免受CoCl2诱导的低氧损伤。
髋关节置换手术是矫治老年人股骨颈骨折的主要手术方式;医院面临逐渐增多的医疗压力。
接受髋关节手术的高龄患者常合并缺血性心脏病、呼吸衰竭、脑血管病后遗症等疾病,此外部分患者服用阿司匹林或其它抗血小板药物致凝血功能轻度异常,对临床麻醉提出挑战。传统观念认为:低位椎管麻醉对呼吸和循环的影响优于全身麻醉,可能更适合髋关节手术的高危人群;但2014年发表于JAMA杂志上一篇回顾性队列研究发现:与全身麻醉下的髋关节手术组相比,椎管麻醉组患者的30天死亡率没有明显下降,仅住院天数较全身麻醉组减少0.6天[1]。临床研究发现:外周神经阻滞对手术患者全身系统的影响,尤其是对心血管系统、呼吸系统的影响小于椎管麻醉和全身麻醉,麻醉后并发症也显著少于后者[2]。以上两项研究对“椎管麻醉是老年患者髋关节手术首选的麻醉方法”这一传统观念提出了挑战。
在缺血性心脏病患者行心脏手术或非心脏手术期间,选择合适麻醉药物维持麻醉的同时保护心肌细胞至关重要[3-5]。丙泊酚是常用麻醉药物,其酚类结构,在发挥强效麻醉镇静功能的同时,还能防止缺血/再灌注对组织的损伤。有学者发现丙泊酚在大鼠心肌细胞和巨噬细胞具有抗氧化作用,机制为:丙泊酚抑制氧化应激相关酶,如:诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、SOD2、p47phox,增加细胞内源性一氧化氮(nitric oxide,NO)释放[6,7],而且可以通过降低Bax的表达从而增加加B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)对细胞活性的促进效应[8]。动物实验中,丙泊酚抑制NF-κB在缺血再灌注心肌组织中的过表达,NF-κB参与心肌缺血再灌注损伤的炎性反应以及心肌细胞凋亡过程[9]。丙泊酚在新生大鼠心肌细胞培养液中可抑制依赖于线粒体,由p53触发以及PKC-δ介导的细胞凋亡信号通路,从而减轻阿霉素诱导的氧化应激和细胞凋亡[10]。丙泊酚还可部分抑制心肌的肥大细胞活化从而减轻心肌缺血再灌注损伤[11]。上述文献表明:丙泊酚通过不同的信号通路在不同的细胞中发挥着广泛的作用。然而,不同浓度丙泊酚对缺血缺氧环境下人心肌细胞的影响和机制仍不清楚。
氯化钴(Cobalt chloride,CoCl2)是由钴和氯组成的无机化合物,可引起类似缺血缺氧的病理环境,是制造低氧模型的一种经典方法,其可以使组织细胞内氧自由基过度生成,抗氧化应激的能力下降,诱发氧化应激损伤细胞[12-15]。本研究拟使用CoCl2处理的人心肌AC16细胞和HCM细胞作为心肌细胞低氧损伤的体外模型,探讨丙泊酚预处理对CoCl2诱导的低氧环境中人心肌AC16和HCM细胞的影响,并探索相关的分子机制。
第一部分筛选丙泊酚预处理浓度和CoCl2诱导人离体心肌AC16及HCM细胞低氧损伤的合适时间与浓度
研究目的:筛选丙泊酚预处理浓度和CoCl2诱导人离体心肌AC16及HCM细胞低氧损伤的合适时间与浓度。
研究方法:培养人心肌AC16细胞和HCM细胞,使用不同浓度的CoCl2(0,125,250,500和1000μM)和不同孵育时间(0,6,12,24或48h)研究其对两种心肌细胞活力的影响,依次筛选出使用CoCl2诱导人AC16和HCM心肌细胞低氧损伤体外模型的合适时间和浓度。使用不同浓度丙泊酚(0,12.5,25,50或100μg/ml)预处理AC16和HCM心肌细胞,再置入按上述实验筛选出适宜浓度CoCl2配制的完全DMEM/F12培养基,在5%CO2环境中以37℃孵育上述实验筛选出的适宜时间,研究丙泊酚预处理两种心肌细胞适宜浓度,通过CCK-8评估心肌细胞活力。此外,在同样实验条件下,将20%的中长链脂肪乳稀释至100,200,400,800或1600倍,分别预处理以上两种心肌细胞,再检测两种心肌细胞活力。
结果:随着CoCl2浓度增加(0,125,250,500和1000μM)孵育12h后,人AC16和HCM心肌细胞活力显著降低,呈浓度依赖性;与250μMCoCl2浓度组相比,于500μM和1000μMCoCl2浓度组抑制心肌细胞活力达到最大效能(P<0.01),所以选择最低有效浓度500μMCoCl2行进一步实验。随着孵育时间的延长(0,6,12,24或48h),使用500μMCoCl2诱发的低氧环境中人心肌AC16和HCM细胞活力显著降低。在使用500μMCoCl2处理12h诱导的低氧组中,AC16和HCM细胞活力分别降低到对照组中获得的值的62.30%(0.7419 /1.1909)和57.13%(0.7739 / 1.3546)(P<0.01)。随后研究显示丙泊酚以浓度依赖性方式逆转因CoCl2诱导低氧环境下AC16和HCM细胞活力的降低。本研究还观察到丙泊酚对CoCl2诱导低氧损伤的保护作用在50μg/ml浓度下最佳(P<0.01)。此外,不同浓度中长链脂肪乳在常氧条件或CoCl2诱导的低氧条件均不影响体外AC16和HCM细胞活力。
结论:CoCl2以浓度和时间依赖性方式降低体外人心肌AC16细胞和HCM细胞的活力。以500μMCoCl2处理AC16和HCM细胞12h可以建立合适的心肌缺氧损伤模型,对CoCl2诱导的低氧损伤,丙泊酚预处理保护作用在50μg/ml浓度下最佳。中长链脂肪乳不影响CoCl2诱导低氧环境下人心肌AC16细胞和HCM细胞活力。
第二部分丙泊酚预处理对CoCl2诱导人离体心肌AC16和HCM细胞低氧损伤的影响
研究目的:丙泊酚预处理对CoCl2诱导人离体心肌AC16和HCM细胞低氧损伤的影响。
研究方法:将AC16细胞分为对照组、CoCl2诱导低氧组(500μM,12h)和丙泊酚(50μg/ml,2h)+CoCl2诱导低氧组。HCM细胞同样分为以上三组。流式细胞术检测各组不同心肌细胞凋亡和线粒体膜电位;ROS敏感荧光探针(DCFH-DA)测定各组心肌细胞中ROS含量;检测各组不同心肌细胞中的总细胞MDA和SOD水平。
结果:(1)丙泊酚(50μg/ml,2h)预处理可防止CoCl2诱导的AC16细胞和HCM细胞凋亡,并显著抑制CoCl2诱导的AC16细胞和HCM细胞的线粒体膜电位下降;(2)与对照组相比,CoCl2诱导低氧组AC16细胞和HCM细胞中ROS和MDA水平升高,SOD水平显著降低(P<0.01),而丙泊酚+CoCl2诱导低氧组,CoCl2处理前2h使用50μg/ml丙泊酚预处理,两种心肌细胞上述指标均显著改善(P<0.05)。
结论:丙泊酚预处理AC16细胞和HCM细胞可显著减少细胞凋亡和线粒体膜电位下降,减轻ROS和MDA的过释放,并有效抑制CoCl2诱导两种心肌细胞的SOD降低和氧化应激反应程度。
第三部分丙泊酚预处理对CoCl2诱导人离体心肌AC16和HCM细胞低氧损伤保护机制的分子途径
研究目的:丙泊酚预处理对CoCl2诱导离体人心肌AC16和HCM细胞在低氧损伤保护机制的分子途径。
研究方法:蛋白质印迹用于评估信号传导途径的激活。将AC16和HCM细胞以不同浓度丙泊酚(0,10,25和50μg/ml)预处理2h后再用500μMCoCl2处理12h,检测MAPK(p38、ERK和JNK)信号传导通路是否激活。
结果:CoCl2可以显著促进AC16细胞中JNK和p38的磷酸化和HCM细胞中JNK的磷酸化,丙泊酚(0,10,25和50μg/ml)预处理2h后不影响离体人心肌AC16和HCM细胞中ERK磷酸化,但是可以通过丙泊酚(50μg/ml,2h)预处理显著抑制AC16细胞中JNK和p38的磷酸化(P<0.05)和HCM细胞中JNK的磷酸化(P<0.05)。
结论:丙泊酚(50μg/ml,2h)预处理可能通过调节JNK或p38信号通路保护人心肌AC16细胞和HCM细胞免受CoCl2诱导的低氧损伤。