[研究背景]帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是目前世界范围内中老年人最常见的神经退行性疾病之一,PD的病理特征主要为中脑黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元选择性丢失及残存神经元中路易小体(Lewy body)的出现。PD发病机制复杂,到目前为止尚不能完全明了,近年来的研究证明固有免疫与帕金森病之间联系密切。细胞内的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白家族,称为NOD样受体(NOD-like receptors, NLR)是固有免疫领域的研究热点,其中NOD2是NLRs家族最早发现的分子之一,其介导的免疫炎症反应在机体防御和炎症性疾病中发挥着关键作用。研究表明,NOD2基因多态或移码突变与克隆病、Blau综合征等炎症性疾病存在密切联系。近来临床流行病学资料提示NOD2基因突变可能与PD相关,但是迄今尚无NOD2在帕金森病中的明确作用及机制的研究。越来越多的研究证明,活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)介导的氧化应激反应是导致PD损伤的重要原因之一,由NADPH氧化酶复合体(NADPH oxidase, NOX)产生超氧阴离子(superoxide O2-)是ROS最重要的来源,已有文献报道抑制依赖于NOX2的氧化应激反应可以明显改善PD模型DA能神经损伤,但NOX2与NOD2在PD中的关系尚不清楚。本课题将应用6-OHDA诱导的PD动物模型深入探讨NOD2在帕金森病中的重要作用及NOX2对NOD2信号通路的分子调控机制,首次揭示NOD2信号通路在PD中的作用,充实完善PD的病理生理机制,为帕金森病的防治提供新的靶点和思路。[研究目的]明确NOD2在帕金森病动物模型中的表达情况,探讨NOD2介导的免疫炎症反应在帕金森病发病过程中的作用,并从NADPH氧化酶NOX2介导的氧化应激反应和凋亡相关信号通路角度深入探讨NOD2参与帕金森病的作用机制,阐明NOD2参与帕金森病的作用及可能的作用机制。[研究方法]1.确定NOD2在6-oHDA诱导的PD模型中的表达应用脑立体定位仪,采用纹状体区单侧双点定位注射6-oHDA的方法造成C57BL/6小鼠偏侧损伤PD模型,用来模拟PD的慢性病程,分别于处理后第1天、2天、3天、7天、14天及21天,观察及检测下列指标：1.1阿扑吗啡诱导的小鼠旋转行为学改变；1.2 Western BlOt检测黑质及纹状体内NOD2和酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)的蛋白水平；1.3免疫荧光检测NOD2的表达。2.确定NOD2在PD中的作用野生型C57BL/6小鼠和NOD2-/-小鼠纹状体定位注射6-oHDA或MDP后,观察及检测下列指标：2.1 Western Blot检测小鼠黑质及纹状体内TH的蛋白表达变化；2.2采用液相色谱法-质谱联用(Liquid chromatography—mass spectrometry, LC-MS)系统检测纹状体内DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(DihydroxYPhenylacetic acid,DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid.HVA)的含量；2.3免疫组化检测黑质和纹状体内TH的表达。3.探讨NOD2诱导PD的发病机制野生型C57BL/6小鼠和NOD2-/-小鼠纹状体定位注射6-oHDA或MDP后,观察及检测下列指标：3.1采用免疫荧光方法观察小鼠黑质中星型胶质细胞和小胶质细胞的增殖及活化情况；3.2微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array, CBA)检测小鼠纹状体内炎性介质的含量变化；3.3 DCFH-DA荧光标记法检测小鼠纹状体内ROS含量；3.4 Western Blot检测纹状体内gp91phox(NOX2),胞浆p47phox,,胞膜p47phox以及总p47phox的蛋白表达变化；3.5采用TUNEL染色的方法检测黑质部位凋亡细胞数的变化；3.6 Western Blot检测凋亡信号通路各蛋白(B AX、Bcl-2、Cytochrome C-、caspase-9、 caspase-3)表达情况。[研究结果]1.6-OHDA诱导的PD模型小鼠黑质和纹状体内的NOD2蛋白水平呈时间依赖性明显升高。2.纹状体区单侧双点注射MDP后,纹状体和黑质中TH的蛋白水平随时间延长逐渐降低,提示NOD2特异性配体MDP可以诱导小鼠DA能神经元的损伤。3.NOD2基因敲除可以减轻6-OHDA诱导的PD模型小鼠脑内DA能神经元的缺失和损伤。4.纹状体注射6-OHDA或MDP可诱导小鼠黑质和纹状体内星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖及活化,促进炎性介质IL-6,MCP-1的释放,而NOD2基因敲除可以抑制6-OHDA诱导的炎性细胞的增殖与活化及炎症因子的释放,提示炎症反应参与了NOD2介导的PD的发病进程。5.纹状体注射6-OHDA或MDP可诱导纹状体内ROS含量明显升高, NOX2,胞膜p47phox以及总p47phox的蛋白表达水平有所升高,胞浆p47phox蛋白表达无明显变化,而NOD2基因敲除可以抑制6-OHDA诱导的NADPH氧化酶介导的氧化应激反应,提示NOX2介导的氧化应激参与了NOD2引起的DA能神经损伤过程。6.纹状体注射6-OHDA或MDP可诱导黑质部位神经元凋亡,凋亡通路相关蛋白BAX、Cytochrome C、caspase-9、 caspase-3蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平明显降低,NOD2基因敲除可以减轻6-OHDA诱导的细胞凋亡,提示凋亡相关信号通路参与了NOD2介导的PD的发病进程。[研究结论]在6-OHDA诱导的帕金森病动物模型中NOD2的表达上调,6-OHDA和MDP可诱导野生小鼠黑质内星型胶质细胞和小胶质细胞的增殖与活化,促进炎症因子IL-6及趋化因子MCP-1的释放,激活NADPH氧化酶产生ROS,引起DA能神经元损伤和凋亡,而敲除NOD2基因可减轻6-OHDA诱导的小鼠DA能神经元损伤。