粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens Bizic)PS-1属于革兰氏阴性菌,是一类高效的昆虫致病菌。昆虫取食带病原物的食物,可通过肠道感染甜菜夜蛾等多种农业害虫。昆虫肠道免疫系统是防御PS-1侵染的第一道防线,但其免疫分子机制不清楚。为从蛋白水平上阐明甜菜夜蛾肠道免疫PS-1的分子机制,本研究利用iTRAQ技术测定PS-1侵染甜菜夜蛾5龄幼虫第3d的肠道蛋白质组,以本实验室深度测序的转录组为参考,筛选出甜菜夜蛾肠道免疫PS-1的差异蛋白211个,其中上调蛋白86个,下调蛋白125个。为从mRNA水平去检测差异蛋白的表达情况,我们从蛋白库中筛选出差异表达比较大的蛋白点,结合转录组获得的unigene片段。筛选了11个差异基因(JNK、Afadin、Hemolin、Unigene19139、Unigene50、Unigene25585、Unigene29765、Unigene4584、C L1044、Unigene14488、C L2840),qRT-PCR结果显示,甜菜夜蛾在饲喂PS-1第3d,JNK、Unigene19139、Unigene29765分别上调3、2、4倍左右,并且达到差异显著水平(p<0.05),而Afadin、Hemolin、Unigene25585、CL1044、Unigene14488、CL2840基因下调,其中Hemolin、Unigene25585、CL2840达到差异显著水平(p<0.05)。验证结果与测序结果基本一致。qRT-PCR检测表明,有蛋白差异的5个免疫相关基因(IMD、relish、IKK、TAB、Cecropin)的表达模式与iTRAQ测序结果一致。为进一步明确JNK和Afadin这两个基因在甜菜夜蛾中的功能,本研究结合甜菜夜蛾转录组获得的免疫相关基因JNK和Afadin unigenes片段的基础上,利用RACE技术克隆这两个基因的unigenes,获得长度分别为1569bp和2729bp。系统进化树分析显示甜菜夜蛾JNK和橘小食蝇、脐橙螟、家蚕中JNK在同一分支上,表明进化关系较近;甜菜夜蛾Afadin和橘小食蝇中Afadin在同一分支上。qRT-PCR结果表明,甜菜夜蛾添食PS-1菌后,JNK和Afadin在中肠的表达量明显提高;qRT-PCR检测JNK在甜菜夜蛾不同发育阶段的表达模式可知,JNK在幼虫的表达量与其他时期相比达到显著差异水平,且在蛹期几乎不表达,JNK的表达量变化趋势为:幼虫>卵>成虫>蛹。为明确PS-1菌株侵染甜菜夜蛾后,JNK蛋白在肠道含量。SDS-PAGE和western blot分析表明,PS-1菌株侵染甜菜夜蛾后第2d和第3d,JNK蛋白在甜菜夜蛾肠道的含量均出现上升的趋势,表明PS-1可诱导JNK蛋白在甜菜夜蛾肠道中含量的变化。综上所述,本研究利用iTRAQ技术测定了PS-1侵染甜菜夜蛾肠道的蛋白组学,并筛选了甜菜夜蛾肠道免疫PS-1的差异蛋白;qRT-PCR初步探讨了甜菜夜蛾免疫防御粘质沙雷氏菌PS-1的基因表达情况,初步结果表示,JNK参与了甜菜夜蛾抵御粘质沙雷氏菌的免疫反应。本研究的结果为开发以甜菜夜蛾肠道免疫为靶标的细菌杀虫剂提供了理论基础。