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树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是体内已知功能最强的抗原递呈细胞(antigenpresenting cell,APC)，在体内外唯一能直接激活初始型T细胞（na ve T cell），进行加工、处理和递呈到组织相容性抗原（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子上，并激活细胞毒T细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL），在抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用。而肿瘤患者体内DCs存在数量和功能上的缺陷，无法诱导初次免疫应答和激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应，使机体无法对肿瘤抗原产生再次免疫应答。原发性肝癌（因主要是肝细胞肝癌，故称为hepatocellular carcinoma，HCC，简称“肝癌”）一种高度恶性的肿瘤，我国是肝癌高发的国家，每年的发生率占全世界的54%。肝癌的评价生存期一般不超过6个月，对放、化疗均不敏感，故现行治疗肝癌的方法主要还是以手术等局部治疗为主的综合治疗，尽管如此，目前我国肝癌患者总体的五年生存率仅在10％左右，中晚期肝癌的五年生存率更低。近年来，肿瘤的免疫治疗成为肿瘤研究的新热点，其中以DCs为基础的肿瘤疫苗（简称DC瘤苗）在实验性肝癌免疫治疗中取得了良好效果。目前，国内外学者大多采用肿瘤细胞冻融裂解物、AFP多肽等负载DCs治疗肝癌，也都取得了一定的疗效，但因负载物单一、免疫原性低，其产生的免疫反应较低，疗效也有限，因此，探索新的负载物，构建新的高效DC瘤苗对肝癌的临床治疗有着重要的意义。HBV感染与HCC的发生密切相关，进一步的研究表明HBV X基因的编码蛋白HBx蛋白（HBxAg）在HCC的发生过程中起着重要的作用。HBxAg在肝癌组织中的阳性表达率达70%－80%,因此HBxAg可作为理想的抗原识别靶点，将HBxAg作为抗原负载DC，制备DC疫苗将可能成为肝癌生物免疫治疗的一个新的思路。热休克蛋白70（HSP70）家族是一类重要的应激蛋白，在肿瘤勉一中发挥免疫佐剂的功能，通过分子载体的作用将抗原肽呈递至APC表面，激活CD8+T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的目的，HSP70对开发肿瘤疫苗也有重要的意义。本研究采用以HBV病毒抗原多肽HBxAg作为靶抗原，利用rhHSP70结合多肽的生物学活性，体外制备rhHSP70-HBxAg复合物增强多肽的稳定性与抗原性，采用人体专职性抗原递呈细胞DCs作为rhHSP70-HBxAg复合物的承载体，增加疫苗的免疫原性，制备rhHSP70-HBxAg-DC活细胞瘤苗，并进一步研究该瘤苗对HBxAg表达阳性的肝癌细胞的杀伤效能。第一部分构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能目的：构建rhHSP70-HbxAg-DC瘤苗，并鉴定其生物学功能。方法：（1）采集HLA-A2+健康献血员外周血，经Ficoll分离获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），其中贴壁细胞经体外诱导产生DCs，每日观察DCs形态变化；（2）DCs生长第7日开始负载不同浓度的rhHSP70、HBxAg及rhHSP70-HBxAg复合物，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR的表达，ELISA检测细胞培养上清中IL-12的分泌，寻找出最适抗原负载浓度；（3）未贴壁细胞经尼龙毛柱分离获得T淋巴细胞，以最适抗原浓度体外构建rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗，并将T淋巴细胞与rhHSP70-HBxAg-DC共培养诱导效应细胞及特异性CTL细胞，CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。结果：（1）随着培养时间的延长，DCs出现拉长，呈细树枝状典型形态；（2）不同浓度的rhHSP70及HBxAg负载DCs后流式细胞仪检测DC表型的表达及ELISA检测IL-12的分泌显示两种抗原的最适浓度分别为rhHSP70:20μg/ml，HbxAg:5μg/ml；（3）负载抗原的DCs，高表达CD80、CD83、CD86、CD11c及HLA-DR，细胞因子IL-12的分泌也显著增加，其中rhHSP70-HBxAg组最高；（4）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可明显刺激T淋巴细胞的增殖。结论：外周血来源的DCs负载rhHSP70和（或）HBxAg后，可分化为成熟DCs，促进T淋巴细胞的增殖。第二部分rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能研究目的：研究rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗对肝癌细胞的杀伤效能。方法：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导T淋巴细胞产生CTL细胞，体外杀伤靶细胞，LDH释放试验检测CTL细胞对不同处理组靶细胞的杀伤效能；（2）用转染了HBx基因的HepG2（HBx-HepG2）建立小鼠皮下移植瘤模型，将30只小鼠随机分为rhHSP70-HBxAg-DC组、未负载抗原的DC组、PBS组，每3日测量瘤体体积，比较各组对裸鼠移植瘤生长的抑制作用；（3）治疗后第28d处死小鼠，分离瘤体，行免疫组化检测瘤体HBx蛋白、AFP以及Bcl-2、PCNA、Fas、Bax、Caspase的表达。结果：（1）rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗诱导的CTL细胞能有效杀伤HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞，其中对HBx-HepG2细胞的杀伤最明显，而对NK细胞敏感的K562细胞及正常肝细胞L02无明显杀伤作用，同时对被抗MHC-Ⅰ类复合物抗体处理过的HBx-HepG2细胞与SMMC-7721细胞杀伤效能明显下降；（2）rhHSP70-HBxAg-DC组和对照组的移植瘤生长受到明显抑制，其中rhHSP70-HBxAg-DC组最明显；（3）免疫组化结果显示瘤体组织中有HBx蛋白、AFP的表达；Bcl-2、PCNA的表达较对照组下调，而凋亡相关基因Fas、Bax和Caspase较对照组表达上调。结论：rhHSP70-HBxAg-DC瘤苗可诱导产生特异性抗HBV相关肝癌细胞效应，有一定的临床应用前景。