第一部分 IL-36促进CD4+T细胞IL-9表达及其机制的初步研究　　【目的】IL-1家族成员IL-36包括IL-36α、β和γ，它们具有共同的受体IL-36R。Th9细胞以分泌IL-9为主要标志，IL-9是Th9细胞抗肿瘤免疫应答的重要构成组分。本部分研究旨在利用IL-36β来激发IL-36/IL-36R信号，分析其能否促进CD4+T淋巴细胞亚群 IL-9的表达，并探讨其作用机制。　　【方法】取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，用免疫磁珠纯化CD4+T淋巴细胞，在Th0、Th1、Th2、Th9，Th17和Treg（CD4+Foxp3+）极化条件下，加或不加入IL-36β，经刺激培养后，收集细胞并裂解，抽提RNA，逆转录后使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各细胞亚群极化条件下IL-9 mRNA的表达。同时，在IL-4， TGF-β，IL-36β三种细胞因子不同组合刺激培养条件下，收集细胞及培养上清，经ELISA检测各培养条件IL-9蛋白水平的表达，并且经流式细胞术检测各种培养条件下IL-9及Foxp3的表达水平。此外，在STAT6、IKK抑制剂分别存在的情况下，加或不加入IL-36β，通过ELISA检测Th9极化条件下IL-9表达水平的变化。　　【结果】结果表明，体外培养的CD4+T细胞经IL-36β分别刺激24hr，48hr， 72hr，其IL-9 的mRNA表达均明显上调；CD4+T细胞在Th9极化条件下，加入IL-36β，IL-9及其转录因子PU.1的mRNA表达水平均明显上调；同时发现IL-36β对IL-9上调作用呈剂量依赖性；与TGF-β或TGF-β联合IL-4组相比，加入IL-36β后经ELISA 和流式检测，发现其均能明显促进IL-9在蛋白水平上的表达；此外，流式检测结果表明，IL-36β在上调IL-9表达的同时，抑制了Foxp3的表达；进一步，尚发现STAT6、IKK抑制剂对IL-36β介导的Th9极化条件下IL-9的上调具有明显的抑制作用。　　【结论】IL-36/IL-36R信号能显著促进CD4+T细胞多种亚群极化条件下IL-9的表达，并上调IL-9转录因子PU.1的表达；IL-36在Th9极化过程中的作用可替代甚至超越经典途径中IL-4的功能；IL-36对Th9/CD4+Foxp3+调节性T细胞间的平衡具有调控作用；IL-36对IL-9表达的促进作用依赖于STAT6和IKK途径。　　第二部分 IL-9在IL-36介导的抗肿瘤免疫应答中作用的初步分析　　【目的】 我们前期的研究表明IL-36能显著促进肿瘤免疫应答、抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存期，且IL-36能显著上调CD4+T细胞IL-9表达，但IL-9及Th9细胞在其中的作用尚不清晰。本部分研究旨在利用过表达IL-36γ的肿瘤细胞，构建荷瘤小鼠模型，拟探讨IL-36信号对肿瘤的抑制作用是否部分依赖于IL-9的存在，及IL-9的缺失是否影响到IL-36介导的抗肿瘤免疫应答。　　【方法】 将B16-IL-36γ及对照B16-vec肿瘤细胞分别腹部外侧皮下接种于C57BL/6J WT小鼠及IL-9基因敲除（IL-9 KO）小鼠，构建荷瘤小鼠模型，每2天测量小鼠肿瘤大小及观察小鼠生存状况，绘制小鼠肿瘤生长曲线和生存曲线；16天取各组小鼠肿瘤，经免疫荧光抗体标记和流式细胞术检测，分析各组荷瘤小鼠肿瘤微环境中免疫细胞亚群及细胞因子的变化。　　【结果】 结果表明，IL-36γ显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期，而IL-9的缺失部分抑制了IL-36γ介导的抗肿瘤作用；IL-9缺失后B16-IL-36γ肿瘤浸润的CD45+ 细胞群体（CD45+TILs）呈下降趋势，但未见统计学差异，CD4+和CD8+T细胞，CD19+B细胞和NK细胞在CD45+TILs中的比例也未见统计学差异性变化；然而对T细胞活化的分析结果表明，CD4+TILs和CD8+TILs细胞活化标志CD44在IL-9缺失的情况下发生了明显下调；此外，IL-9缺失后，IFN-γ在B16-IL-36γ肿瘤浸润的CD8+TILs细胞中的表达呈下降趋势，但无明显的统计学差别，同时CD4+TILs中IFN-γ表达亦无明显差异。　　【结论】IL-36对肿瘤的抑制效应部分依赖于IL-9的存在；IL-9的缺失虽然对IL-36过表达情况下肿瘤浸润淋巴细胞的比例和构成未造成显著性的影响，但对CD4+TILs和CD8+TILs细胞的活化造成了负面影响，这可能是其参与构成IL-36介导的抗肿瘤作用、而在缺失后又影响到IL-36抗肿瘤的重要机制之一。