食管癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，其生物学特征为易复发和转移，预后差，死亡率高。尽管目前食管癌的治疗方案(手术切除、放化疗、生物治疗等)日趋完善，但仍难以取得令人满意的疗效。因此研究食管癌的发病机理以及探讨新的可行的治疗方案具有极其重要的临床意义。随着肿瘤学基础研究的不断深入，人们发现在肿瘤组织中存在一些与肿瘤血管生成有关的生长因子及其受体过表达的现象；并且提出了肿瘤生长的血管依赖性学说，为探讨肿瘤的发生机制奠定了基础。血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的促血管生长因子，它参与肿瘤细胞的生长、分化、转移、增殖等过程，并与多种肿瘤包括食管癌的发生、发展有密切的相关性。目前，国内外针对VEGF基因表达与食管癌分化程度、生长方式、临床特点的关系尚未进行深入系统的研究。针对食管癌的VEGF反义基因治疗尚无报道。本课题从三个方面进行了相关系统研究：1.VEGF基因表达与食管癌恶性程度、临床特点、微血管密度间的相关性。2.采用脂质体体外转染VEGF反义RNA，观察转染后肿瘤细胞在体外的生长情况及VEGF表达情况。3.VEGF反义RNA转染后肿瘤细胞体内生长情况观察。结果将为探讨以VEGF为优选靶进行基因治疗，阻止肿瘤的发生和发展，提高生存率，延长生存期奠定理论基础。第一部分 血管内皮生长因子基因(VEGF)在人食管癌中的表达及其临床意义目的：探讨在食管癌细胞中VEGF基因的表达水平，分析它与食管癌生物学特性之间的相互关系。方法：利用免疫组化的方法研究了55例人食管癌组织中VEGF的蛋白表达与肿瘤血管生成的关系；应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了人食管癌细胞株TE-1、TE-10和11例食管癌组织和癌旁组织<WP=5>VEGFmRNA的表达，探讨了以VEGF为靶点治疗食管癌的可行性。结果：1. VEGF蛋白在食管癌组织的阳性表达率为70.9%，VEGF蛋白的表达水平与食管癌组织的病理学分级、浸润深度、淋巴结转移有关；而与肿瘤大小、TNM分期、性别、年龄无关。提示VEGF在食管癌的发生、发展中起重要的作用。2. 食管癌组织中微血管分布不均，血管密集区主要集中在癌灶边缘；MVD与肿瘤分化程度、淋巴结转移相关；MVD与VEGF的表达之间存在正相关性（r=0.456，P<0.01）。提示VEGF具有促进肿瘤血管形成的作用。3. 食管癌细胞株TE-1、TE-10和食管癌组织中的VEGFmRNA表达以VEGF189、VEGF165、VEGF121三种亚型为主；肿瘤组织VEGFmRNA的表达量比癌旁组织增高(P＜0.01)；VEGF121和VEGF165两个低分子量亚型表达量较高。结论：VEGF基因在食管癌组织中呈过度表达现象可能与食管癌的发生、发展有关；并且与肿瘤恶性程度、转移、微血管形成能力相关。此研究结果对深入探讨食管癌与VEGF基因的关系提供了有意义的理论基础及实验依据。第二部分 VEGF反义RNA对食管癌细胞TE-1的体外抑制作用的研究目的：研究TE-1细胞经VEGF反义RNA处理后对细胞增殖周期及细胞凋亡的影响。方法： 1.质粒的扩增、提取及鉴定：采用DH5α大肠杆菌为工作菌，制备感受态细菌，扩增质粒，提取质粒DNA，并经酶切鉴定以备转染使用。2．细胞的转化、细胞体外增殖及VEGF封闭作用检测：利用高表达VEGFmRNA及蛋白的食管癌细胞系（TE-1细胞）为体外细胞系模型，将含有反义VEGFcDNA、pcDNA3.1空载体质粒通过脂质体导入TE-1细胞；用MTT法检测三组细胞（转染反义RNA组、空载体组和对照组）增殖情况；采用免疫组织化学法检测三组细胞VEGF基因的蛋白表达；细胞原位杂交和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测三组细胞VEGFmRNA的表达；流式细胞术检测三组细胞的凋亡率和细胞周期分布。结果：1. 采用脂质体可以成功地将VEGFcDNA转入食管癌TE-1细胞中；2. 三组细胞（转染反义RNA组、空载体组和对照组）体外增殖反应无明显差异；3.与对照组和空载体组细胞相比，反义组的TE-1细胞表<WP=6>达的VEGF蛋白和VEGFmRNA表达水平明显降低（P<0.05）；4.转染VEGF反义cDNA后的食管癌TE-1细胞，其内源性的VEGF基因表达水平显著下调(P<0.05)；而转染空载体的TE-1细胞VEGF的表达水平与未转染细胞的VEGF表达水平相似；5.三组细胞（转染反义RNA组、空载体组和对照组）的细胞周期分布情况相似，未见明显凋亡发生。结论：采用脂质体可以成功地将VEGFcDNA转入食管癌TE-1细胞中，使TE-1细胞VEGFmRNA及蛋白的表达受到抑制；由于体外细胞系无血管形成，VEGF反义RNA对肿瘤细胞的增殖反应无明显抑制作用，未发现导致肿瘤细胞凋亡发生。需要进一步观察肿瘤细胞转染VEGF反义RNA后在体内的生长情况。第三部分 VEGF反义RNA抑制食管癌TE-1细胞在裸鼠体内生长的实验研究目的：将经脂质体转染的VEGF反义RNA导入TE-1细胞，在裸鼠体内进行成瘤实验，进一步证实VEGF反义RNA在体内对TE-1细胞的抑制作用。方法：将BABL/c/ nu裸鼠随机分为三组：转染VEGF反义RNA组（简称反义组）、转染空载体组（简称空载体组）、不转染任何载体的对照组（简称对照组）。于每只裸鼠左前肢皮下分别接种等量的不同转染细胞（1×10 6/20μl/只），接种4周后终止实验。观察各组裸鼠移植瘤的生长情况，计算最终的成瘤率；应用免疫组化法检测移植瘤组织中