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香蕉(Musa SPP.)是重要的热带水果之一,也是世界上继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。在我国华南地区,种植香蕉已成为农民的主要经济来源,在热区经济和农村社会发展中发挥着越来越重要的作用。香蕉对低温非常敏感,周期性的寒害给我国香蕉产业造成了巨大的经济损失。培育抗寒品种是解决香蕉寒害的重要途径。香蕉的主栽品种大多为三倍体,难以通过传统育种方式培育抗寒品种,而转基因技术为培育抗寒品种提供了很好的途径。拟南芥CBF1是COR(cold regulated)冷应答基因的转录激活因子,其发现为基因工程改良植物抗逆性提供了一条重要的途径。该类转录因子能与下游COR基因启动子上的核心元件CRT/DRE特异结合,促进下游一系列基因的表达,激活植物体内的多种耐逆性机制,从而提高转基因植株耐低温、干早和高盐等非生物胁迫的能力。在此基础之上,很多学者进行了拟南芥CBF1(AtCBF1)基因转化各种植物的研究,并取得了理想的抗寒效果。本研究利用农杆菌介导,转化由花椰菜花叶病毒35S启动子启动的AtCBF1基因到东莞大蕉(Musa spp.ABB group)和夫人指蕉(Musa spp.AA group)的胚性悬浮细胞(ECS)中,经体细胞再生途径,成功获得转基因植株。并对转基因植株的抗寒性进行了检测。构建了转基因大蕉的SSH-cDNA文库,以筛选与抗寒性相关的内源基因。这些研究结果对香蕉的抗寒育种具有重要的理论和实际意义。本研究获得的主要研究结果如下：1.根据GenBank中公布的AtCBFl基因cDNA全序列,设计特异引物从野生型拟南芥中扩增出目的基因的全序列,经比对与CBF1基因(NM118681)的同源性为100%。利用质粒PBI121及pCAMBIA1301构建其植物表达载体p1301-CBF1并转化农杆菌菌株EHA105,制备工程菌以转化香蕉。2.以大蕉(Musa spp.ABB group)和夫人指蕉(Musa spp.AA group)的未成熟雄花为外植体,诱导愈伤组织和胚性愈伤组织,对胚性愈伤组织进行液体培养成功地诱导出了这两个品种的ECSs。然后,建立了ECSs途径的再生体系。3.利用农杆菌EHA105介导大蕉(Musa spp.ABB group)和夫人指蕉(Musa spp.AA group)的ECSs,侵染和共培养之后,在含有5mg/L潮霉素(Hyg)和400mg/L头孢菌素(Cef)的MS培养基中进行体胚筛选和萌发。萌发的抗性胚生根后,获得的抗性植株。4.经GUS组织化学染色和PCR扩增检测,获得了大蕉6个转基因株系,共53株,10个株系的转基因夫人指蕉,共102株,证明了AtCBF1基因已整合至香蕉的基因组内。形态学观察发现,转基因大蕉和夫人指蕉植株均表现出矮化、叶片增厚及叶色深绿等表型。5.利用RT-PCR和qRT-PCR对外源基因AtCBF1的表达进行定性和定量检测,结果验证了AtCBF1基因在转基因大蕉和夫人指蕉中均获得了表达,同时qRT-PCR的结果表明,AtCBF1基因的表达水平在各转基因株系中存在差异。6.在7℃低温下处理5天,对2个转基因大蕉株系(T1和T3)和2个转基因夫人指蕉株系(L1和L4)进行抗寒性相关的生理生化指标测定。结果显示,转基因大蕉和夫人指蕉的离子渗漏率、丙二醛(MDA)含量均要低于对照植株；而转基因大蕉的SOD活性高于对照植株,脯氨酸含量、可溶性糖含量和叶片的相对含水量在转基因大蕉和夫人指蕉中均高于对照植株。7.各20株转基因大蕉和夫人指蕉置于4℃低温分别处理5天和3天后,观察其冷害症状。转基因大蕉没有出现冷害症状,而对照已出现了萎焉脱水症状,但均没有发现冷害致死现象。转基因夫人指蕉低温处理后叶片稍微卷曲,但没有表现出冷害症状,而对照植株出现严重脱水,25℃恢复生长3天后,高达90%对照植株死亡,而转基因植株无死亡的现象。这些结果直观显示,过量表达AtCBF1基因的转基因大蕉和夫人指蕉的抗寒性均获得了提高。8.本研究构建了转基因大蕉的SSH-cDNA文库,从文库中筛选到了Clp基因和乌头酸水合酶基因,这两个基因均与抗逆性有关。利用qRT-PCR对Clp基因的表达进行验证发现,Clp基因在转基因植株内表现上调。因此推测,AtCBF1蛋白可能调控了内源基因Clp和乌头酸水合酶基因等的表达,提高了转基因植株的抗寒性,需要进一步的验证。