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马铃薯甲虫[Leptinotarsa decemlineata (Say)],属鞘翅目,叶甲科,是国际公认的毁灭性检疫害虫,也是我国对外重大检疫对象和重要外来入侵物种之一。马铃薯甲虫于上世纪90年代从哈萨克斯坦入侵中国,现分布于新疆维吾尔自治区北疆的大部分县(市)。马铃薯甲虫在新疆北疆严重为害马铃薯和茄子。化学防治是一种经济、高效的治理措施,但马铃薯甲虫极易对化学药剂产生抗药性。因此,监测其抗药性及研究其抗性机制十分重要和迫切。一、马铃薯甲虫抗药性的分子检测马铃薯甲虫乙酰胆碱酯酶AChE S291G突变和钠离子通道LdVssc1L1014F突变分别导致对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯的抗药性。采用改进的Bi-PASA技术,于2010年分别检测了新疆特克斯县、察布查尔县、昌吉市、乌鲁木齐市和奇台县马铃薯甲虫田间种群AChE S291G抗性突变,抗性纯合子(RR)和杂合子(RW)分别是17.6%和14.7%、50.6%和42.2%、49.9%和41.7%、51.3%和41.4%、以及44.8%和47.4%。检测了LdVssc1L1014F抗性突变,抗性纯合子(RR)和杂合子(RW)分别是5.8%和8.7%、36.1%和27.0%、41.8%和24.8%、12.2%和9.7%、以及7.9%和10.6%。用RT-PCR检测了察布查尔县、昌吉市、乌鲁木齐市和奇台县马铃薯甲虫田间种群共18头,未发现突变I392T,但是大多数马铃薯甲虫有突变S291G。这些数据显示,具有抗性突变纯合子MM的个体概率很高,含敏感纯合子WW的个体概率很低。二、不同靶标农药及其复配剂对马铃薯甲虫的毒力通过浸液法测定特克斯马铃薯甲虫2龄、3龄、4龄幼虫和成虫对硫丹的胃毒毒力。2龄的马铃薯甲虫对硫丹的胃毒毒力最大,3龄、4龄依次减小,成虫的最小。在LDso值水平,硫丹的相对毒力指数依次是698.4、247.7、11.4和1.0；在LD90值水平,硫丹的相对毒力指数依次是546.8、212.7、10.1和1.0。运用点滴法测定各农药不同比例混合物对马铃薯甲虫成虫的触杀毒力。硫丹和辛硫磷以1：24混合,CI显著小于1,表现为增效作用。硫丹和水胺硫磷以1：72和1：288比例混合,CI显著小于1,表现为增效作用。三、马铃薯甲虫细胞色素P450单加氧酶分子克隆及组织表达马铃薯甲虫转录组中,细胞色素P450超家族现已验证的基因片段共38条,并由P450国际委员会Nelson博士命名。为了全面分析马铃薯甲虫P450基因,我们综合了NCBI已有序列以及本实验室前期结果,发现马铃薯甲虫中CYP450属于人类对应基因的CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP450群,共93个。其中CYP2群具有CYP18、CYP305、CYP306和CYP307家族基因各1个。CYP4群中包括CYP4家族、CYP350家族、CYP412家族和CYP413家族基因分别为20、3、2和1个。CYP3群中包括CYP6家族基因23个,CYP9家族基因17个,CYP345家族基因7个,CYP347家族基因1个。线粒体CYP450群中,CYP12、CYP49、CYP301、CYP302、CYP314、CYP315. CYP334和CYP353分别有7、1、2、1、1、1、1、1个。还发现三个未知的新基因CYP412a1、CYP412a2和CYP413al。利用RACE技术获得与蜕皮激素代谢相关CYP18al、CYP306a1、CYP307a1、CYP302a1、CYP314a1和CYP315a1基因的全长。四、马铃薯甲虫持家基因筛选及干扰蜕皮激素代谢相关P450基因产生的效应分析本章首先筛选了相对荧光定量PCR的2个内参基因ARF1和RP18。接着运用喂食表达dsRNA的大肠杆菌的方法,干扰马铃薯甲虫6个编码蜕皮激素代谢相关CYP18a1、CYP306a1、CYP307a1、CYP302a1、CYP314a1和CYP315a1的Cyp基因。Qpcr证实RNAi后,对应靶基因相对表达量均有明显的下调。这些基因被干扰后,严重影响了马铃薯甲虫的存活率,存活个体体重、化蛹率和发育历期。喂食表达dsRNA大肠杆菌的同时用点滴法给马铃薯甲虫施加20-羟基蜕皮酮(20E)或蜕皮激素类似物氯虫酰肼后(Hal),可以部分补偿蜕皮激素合成相关酶基因被干扰后的不利影响,加重蜕皮激素降解酶被干扰后的不利影响。这一方法的成功,为基因的功能验证及RNAi方法的田间应用奠定了基础。