BmNPV/家蚕表达系统是一个以杆状病毒BmNPV为外源基因载体,以家蚕为受体的真核表达系统,具有外源蛋白表达量高、表达产物能进行折叠和修饰具有生物活性、安全、高效等特点。家蚕作为该系统的表达载体,是目前唯一可大规模人工饲养的经济昆虫,且饲养成本极为低廉,该系统在基因工程药物、疫苗等方面具有广阔的应用前景。为了在BmNPV/家蚕表达系统中最大程度、稳定地表达重组蛋白,有必要准确测定病毒滴度。目前已报道多种滴度鉴定方法,但大都存在耗时长、操作繁琐、稳定性不高等缺点,且大部分方法仅适用于AcMNPV。VP39蛋白是杆状病毒主要的核衣壳蛋白,在不同杆状病毒间具有较好的同源性,其中BmNPV和AcMNPV VP39同源性高达93.7%。本研究通过制备针对AcMNPV和BmNPV高保守区段的VP39蛋白的抗体,利用酶联免疫斑点法,初步建立了一种可快速鉴定以上两种病毒滴度的方法。该方法的成功建立亦有助于BmNPV/家蚕表达系统的稳定表达,为该表达系统的进一步应用奠定了必要的基础。本研究首先构建了AcMNPV和BmNPV VP39蛋白的高保守区段（16～903bp）的表达载体pTO-T7-vp39-Ac/Bm,经转化E.coli表达,表达产物约为32kD。VP39蛋白主要表达在包涵体中,目的蛋白可溶于8M尿素,后经电洗脱纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白纯度可达97%以上。然后将重组蛋白VP39-Ac/Bm交叉免疫BALB/c小鼠,并利用常规单抗制备技术和间接ELISA法筛选单抗,最终成功获得了17株抗VP39-Ac/Bm抗原的单克隆抗体。单抗的滴度和亚型通过间接ELISA法分析。经条带免疫印记实验证实,有8株单抗对两种抗原和病毒均有良好的的反应活性。免疫荧光结果表明,有4株单抗与3种已感染的昆虫细胞均有较强反应。扫描共聚焦显示,感染后16h VP39单抗即可与感染后细胞反应。以上4株单抗为一抗,通过酶联免疫斑点（Elispot）法对感染后16h的昆虫细胞sf21和BmN进行检测,结果发现1株单抗与两种细胞均有反应,且与传统方法的检测结果存在较好的相关性。以上结果表明,本研究利用Elispot技术初步建立了一种适用于AcMNPV和BmNPV两种杆状病毒的快速滴度鉴定方法。本研究首先以经密码子改造的红色荧光蛋白（DsRFP）为模式蛋白,在本实验室建立BmNPV/家蚕表达系统。感染后5～6天,肉眼可见蚕体呈现红色。全波长扫描仪对各时间段收集的感染家蚕血淋巴进行检测,发现感染后第5天RFP呈暴发性增长。普遍认为戊肝病毒开放阅读框（ORF）2存在保护性中和表位。本研究构建了含有HEV ORF2 112-606aa共495个氨基酸的重组病毒。对感染宿主研究后发现,感染第5天,目的蛋白在蚕体内出现突然性增长,而蚕蛹中未发现明显变化。家蚕匀浆液和血淋巴的ELISA检测结果显示,>90%的蛋白存于匀浆液中。通过比较不同的匀浆体积,发现10mL缓冲液/3.8g蚕体时,蛋白得率最高。通过以上结果,我们选择家蚕作为感染宿主,感染后5天匀浆处理感染家蚕,按10mL/3.8g蚕体加入匀浆液。将家蚕匀浆液经反复冻融后,使用不同浓度硫铵沉淀处理,发现30%硫铵浓度时,目的蛋白开始沉淀,且纯度可达～60%。经离子交换层析成功的从匀浆液中获得纯度>90%的目的蛋白,电镜下观察可组装成类病毒颗粒（VLP）。对纯化蛋白的抗原性分析发现其与抗HEV单抗均有良好的反应活性,免疫实验显示,经两次加强后抗体滴度可达到2¹²～2¹⁴,表明颗粒性的I-495his蛋白具有良好的免疫原性。为利用家蚕杆状病毒表达系统生产戊肝诊断试剂抗原,及戊型肝炎基因工程疫苗的研制与开发开辟了新的途径。以上结果证明,本研究初步建立了一套完整、有效的BmNPV/家蚕表达系统技术路线,并为克服家蚕表达蛋白难以纯化的难题提供了新的途径。