呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病(VED)模型建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征

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目的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体,其感染引起婴幼儿毛细支气管炎和肺炎,并与儿童哮喘的发生发展有着密切关系。接种疫苗是预防和控制传染病最为有效的措施,但RSV至今尚无安全有效的疫苗产生。以福尔马林灭活RSV疫苗(FI-RSV)预防接种的婴儿或学龄前儿童,自然感染RSV后反而导致更为严重的疫苗增强性疾病(Vaccineenhanced disease,VED)的产生。有研究表明,生化方法提纯的RSV G蛋白免疫和重组G蛋白免疫均有明显的诱导VED效应。另有研究者报道,尽管G蛋白和FI-RSV在免疫病理学方面引起的免疫应答相似,但T细胞介导的应答却不同,即两者引起疾病加重的机理不同。提示G蛋白与VED相关性有待于进一步研究。本研究中我们通过建立福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗相关VED模型并定义其主要特征,为相关免疫调控机理研究提供平台;构建编码RSV G蛋白基因的重组质粒,观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应,探讨表达的G蛋白抗原与VED的相关性,为探索RSV疫苗接种后疾病加重的相关机制以及为研制安全、有效的RSV疫苗提供线索和实验依据。方法制备RSVA1型Long株FI-RSV疫苗;以FI-RSV免疫BALB/c小鼠后以RSV攻击,收集攻毒前后肺组织、血清标本;采用荧光定量RT-PCR检测肺组织标本中病毒滴度,HE染色法检查肺组织病理改变;采用ELISA检测血清标本中RSV特异性IgG水平。利用基因重组方法构建含RSV G蛋白编码基因的重组质粒,测序和酶切鉴定,Western Blot检测目的基因经体外表达后的免疫原性。重组质粒免疫小鼠后以RSV感染,采用上述相同方法分别检测肺组织标本中RSV滴度、肺组织病理改变和血清抗体水平,同时采用双抗体夹心ELISA测定肺泡灌洗液(BAL)内Th1/Th2细胞因子表达量,流式细胞术检测BAL中T淋巴细胞亚群数量及活化状态。结果与对照组相比,FI-RSV免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低,但出现更为严重的肺组织病变,主要是以肺炎、间质性肺炎以及支气管周围炎为主要特征的广泛炎症反应,伴有局部肺气肿。免疫小鼠血清RSV特异性IgG抗体滴度增高,但感染RSV后其滴度明显降低。同时成功构建了编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G。Western Blot证实目的基因表达蛋白在体外具有免疫原性。被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低,肺组织中未见明显的炎性细胞浸润。小鼠血清中产生较高滴度的抗RSV-G IgG。小鼠BAL细胞中CD4+CD25+T淋巴细胞比例显著增加,并且IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)两类细胞因子表达显示平衡。结论本研究成功地建立了FI-RSV免疫BALB/c小鼠感染RSV后VED模型,其主要特征为肺组织中出现与病毒滴度、血清抗体水平不一致的严重病理改变;编码呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G能诱导产生CD4+CD25+T细胞亚群,对小鼠具有明显的保护作用,而未见明显的VED现象产生。
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