研究背景近年来人类基因组计划和其它物种基因组计划的启动和实施，使人类在生命科学领域尤其是核酸和蛋白质等生物大分子的序列、结构与功能等领域迅速积累了大量数据。人们渴求新知的愿望促使人们去挖掘这些巨量数据。由生命科学和信息技术等学科相结合而形成的新兴交叉学科—生物信息学应运而生。在应用研究方面，生物信息学在寻找人类疾病基因、预测基因和蛋白质表达的结构及功能和合理设计药物等方面都起着至关重要的作用。随着分子遗传学的进展，疾病遗传学研究从简单的单基因疾病转向于复杂的多基因疾病(如免疫相关疾病、心血管疾病、各种肿瘤等)的研究中。目前认为基因单核苷酸多态性(SNP)及其特定的组合可能是造成宫颈癌等一些复杂性状疾病易感性的最重要的原因。但寻找与疾病表型相关的遗传位点并非是一项容易的工作。据估计，人类30亿碱基中大约有数百万个SNPs位点。因此，在疾病分子流行病学研究中如何进行基因多态性研究?在如此众多的基因及SNP位点中选择哪些基因以及哪些SNPs位点进行研究?这些已成为许多医学研究工作者共同关注的问题。本研究以分析细胞因子IL-18基因重要单核苷酸多态性位点为例，探讨生物信息学筛选疾病基因SNP位点的方法，并临床评价方法的有效性。研究目的和意义：1、采用生物信息学策略筛选细胞因子IL-18基因重要单核苷酸多态性位点，建立一种筛选疾病相关SNP位点的方法；2、以宫颈癌疾病为例，检测选定的IL-18基因SNP位点基因型，临床评价此SNP是否与宫颈癌相关，从基因水平验证生物信息学筛选策略的有效性；3、以宫颈癌疾病为例，检测IL-18血清水平，临床评价候选SNP位点与IL-18血清水平的关系以及对于疾病的意义，从蛋白水平验证生物信息学筛选策略的有效性。方法：1、生物信息学策略筛选宫颈癌相关IL-18基因SNP位点IL-18是一种1996年命名的多功能细胞因子。我们重点研究存在于调控区以及编码区的SNPs，因为它们直接影响基因的功能和表达水平。由于IL-8调控区范围较大，我们重点研究文献报道的对IL-18转录表达明确调控作用的一段启动子调控区域。使用SNPper软件从公共数据库dbSNP获得IL-18调控区和编码区的SNPs数据。对于编码区SNPs，先使用同源模型数据库搜索得到IL-18同源序列模块Blocks，Blocks是在进化过程中非常保守的区域。然后使用PARSESNP软件进行筛选和分析编码区SNPs是否对基因表达产物产生影响；对于调控区SNPs，使用转录因子结合部位预测软件分析调控区SNPs是否对基因转录表达水平产生影响。从而确定IL-18基因重要SNP，作为与细胞因子IL-18关系密切的疾病研究的候选多态性位点。2、候选IL-18基因SNP位点与宫颈癌相关性研究通过文献检索确定IL-18基因为宫颈癌相关候选研究基因。纳入宫颈癌确诊患者与正常人作为研究对象，采用病例对照研究方法。采集外周静脉血，用直接测序法对候选SNP位点的基因型进行检测，获得候选SNP位点的基因型频率和等位基因频率，然后病例组与对照组之间进行统计分析两者相关性。3、候选IL-18基因SNP位点与宫颈癌患者IL-18血清水平相关性研究纳入宫颈癌确诊患者与正常人作为研究对象。采集外周静脉血，用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清IL-18含量。然后通过析因设计资料的方差分析，检验宫颈癌患病与否以及不同IL-18基因型对IL-18血清浓度变异的主效应与交互效应。4、统计学方法采用SPSS 10.0专业版统计分析软件进行分析。宫颈癌患者组和正常对照组等位基因及基因型分布频率比较采用x~2检验。宫颈癌患者组和正常对照组，以及不同基因型组下的血清IL-18平均浓度之间的比较采用析因设计资料的方差分析。检验水准a=0.05。结果：1、经过SNPper软件分析，共获得候选启动子区5个SNP(rs5744224、rs1946519、rs1946518、rs5744225、rs5744226)，编码区2个SNP(coding SNP，cSNP)(rs549908、rs5744290)。通过分析我们发现IL-18编码区的2个SNP位点由于属于同义SNP，不会影响蛋白功能，所以将2个编码区SNP均排除研究之外。将候选的IL-18基因调控区DNA序列在两个在线预测软件进行潜在的真核转录因子识别位点的搜索分析。其中TFSEARCH搜索分析表明，Score值等于或大于90.0的转录因子结合位点共12个，只有rs1946518这个SNP位点存在于转录因子CdxA(caudal type homeobox transcription factor A，尾型同源异型转录因子A)结合部位；Alibaba2.1软件搜索分析表明，将矩阵保守性参数设置在80％以上，则候选DNA序列的转录因子结合位点共13个，只有rs1946518这个SNP位点存在于转录因子HNF-1C(hepatic nuclear factor 1-C，肝核转录因子1-C)结合部位。其他4个SNP位点均未有转录因子结合。另根据文献检索，rs1946518这个SNP位点还是转录因子3′，5′-环单磷酸腺苷(3′，5′-cyclic adenosine monophoshate，cAMP)反应元件结合蛋白结合区。所以rs1946518很有可能对IL-18的转录翻译水平有重大影响。因此我们选定rs1946518这个SNP位点为IL-18基因的重要候选位点。预测此位点可能影响IL-18的转录表达水平，从而影响机体对疾病的抵抗作用。2、基因直接测序发现调控区5个SNP中有rs1946519(T／G)、rs1946518(A／C)2个SNP位点呈多态性并有连锁关系。rs1946518以三种基因型存在：TT、GG、TG。患者组3种基因型频率分别为56％(28／50)、10％(5／50)、34％(17／50)，对照组3种基因型频率分别18％(9／50)、34％(17／50)、48％(17／50)。宫颈癌患者与对照组之间等位基因T、G频率差异有统计学意义(x~2=19.662，P=0.000)；两组研究对象基因型的分布频率差异有统计学意义(x~2=17.497，P=0.000)。3、测定了所有研究对象血清IL-18含量，结果显示宫颈癌患者与正常对照组之间血清IL-18平均浓度比较差异有统计学意义(F=14.445，P=0.000)；按照rs1946518位点TT、GG、TG三个基因型分为三组，3组的血清IL-18平均浓度差异有统计学意义(F=11.307，P=0.000)；宫颈癌患病与否与不同IL-18基因型之间交互效应显著(F=4.223，P=0.018)。对照组中不同IL-18基因型的血清IL-18浓度比较差异没有统计学意义(F=1.147，P=0.326)。病例组中不同IL-18基因型的血清IL-18浓度比较差异有统计学意义(F=22.445，P=0.000)。进一步用多重比较，TT基因型组的IL-18平均浓度最低，与其它两组的平均浓度之间差异均有统计学意义(P=0.000)。TG组平均浓度虽然比GG组高，但两者之间差异没有统计学意义(P=0.379)。结论：1、用生物信息学策略初筛疾病相关SNP位点，虽然可能忽略某些位点，但不失为一种事半功倍的方法，可以大大减少大规模筛查实验的操作，从而为进一步探讨疾病与某一基因的关联性提供很有价值的信息。2、IL-18基因启动子区rs1946518位点多态性与宫颈癌相关，宫颈癌组T等位基因频率较高，正常对照组G等位基因频率较高。3、IL-18血清浓度变化不但与IL-18基因型有关，而且与宫颈癌发病过程中的其他因素有关。4、IL-18基因rs1946518位点多态性可以影响血清IL-18水平。这可能导致宫颈癌患者的免疫平衡失调，Th1型反应模式占弱势状态，细胞免疫功能不能有效地激活，机体免疫功能处于抑制状态，从而有利于肿瘤的发生及发展。这将会为宫颈癌的早期诊断、一级预防等提供线索，并可制定更可靠的治疗手段。研究创新之处：1、探索建立了一种筛选疾病相关基因的SNP位点的生物信息学策略并作了临床评价，为今后开展类似研究做了方法学基础；2、对细胞因子IL-18基因的重要SNP位点做了筛选；3、提出细胞因子IL-18基因SNP与宫颈癌发病相关，并在基因、蛋白两个水平，对IL-18基因rs1946518位点与宫颈癌的相关性进行了初步探讨，为今后IL-18在宫颈癌的发病风险预测、诊断治疗等方面提供了理论与实验依据。