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仔猪黄白痢(Pigletsyellow-white dysentery)是由某些产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起的初生仔猪肠道传染病,是养猪生产上的常见病和多发病。临床应用抗菌药物虽对仔猪黄白痢的防治起到了积极作用,但随着抗菌药物的大量和不合理应用,仔猪黄白痢大肠杆菌耐药性问题越来越突出,己成为严重影响养猪生产的一个难题。
本文用直肠棉拭子采集浙江省多个规模化猪场黄白痢仔猪的病料,经细菌分离纯化、生化试验和小鼠致病性试验等,鉴定得到47株病原性大肠杆菌。通过WHO推荐的K-B法测定其对16种抗菌药物的耐药性。结果表明,在16种抗菌药物中,细菌对庆大霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、红霉素、强力霉素现出很高的耐药性,耐药率分别为91.4％、93.6％、95.7％、97.8％、100％。进一步的耐药谱分析表明,47株大肠杆菌分离株均对5种及5种以上抗菌药物耐药:5～8种抗菌药物耐药的有6株,对9～11种抗菌药物耐药的有27株,对12～14种抗菌药物耐药的有14株。对10种抗菌药物耐药的菌株所占比例最大,为25.5％,其次是对11种抗菌药物耐药的菌株有8株,占17.0％。没有对15种及15种以上抗菌药物耐药的菌株。
采用琼脂二倍稀释法使平板上接种细菌量分别为1.5×104 CFU、1.2×1010 CFU,测定环丙沙星、麻保沙星、多粘菌素B、壮观霉素对上述大肠杆菌分离株的最低抑菌浓度MIC、防耐药突变浓度MPC,并计算耐药选择指数SI(MPC/MIC)。试验结果表明,受试菌对多粘菌素B、壮观霉素、麻保沙星、环丙沙星的敏感率分别为80.85％、68.08％、17.02％、12.76％,两种喹诺酮类药物已有交叉耐药产生;两种喹诺酮类药物对敏感菌的MPC为1～16μg/mL,SI为4～32,多粘菌素B的MPC为4～16μg/mL,SI为2～8,壮观霉素的MPC为32～128μg/mL,SI为2～32,因此认为多粘菌素B不仅抗菌活性较高,其SI也低于环丙沙星、麻保沙星,即多粘菌素B的防耐药突变能力强于麻保沙星与环丙沙星,壮观霉素虽然抗菌效果明显但是防突变能力与环丙沙星、麻保沙星类似。
Touch-down PCR扩增47株大肠杆菌分离株中磺胺类耐药基因(sulⅠ基因、sulⅡ基因、sulⅢ基因)、氯霉素类耐药基因(cat2基因、Cml A基因、Cml B基因、Flor基因)、四环素类耐药基因(tetA基因、tetB基因、tetC基因、tetD基因、tetE基因、tetG基因),结果表明,47个大肠杆菌分离株中耐药基因sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ、tetA、tetB、CmlA较为普遍,阳性率分别为55.3％、74.5％、72.3％、70.2％、47.6％、51.1％,耐药基因tetD、tetE的阳性率分别为14.9％、19.1％。未能检测到耐药基因tetC、tetG、cat2、Cml B、Flor。磺胺类耐药基因、四环素类耐药基因、氯霉素类耐药基因的阳性率分别为100％、100％、51.1％,与药敏试验的检测结果有较高的一致性,符合率分别为100％、88.4％、79.4％。
对Ⅰ型、Ⅱ型整合酶基因通过PCR体外扩增并经琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明47株大肠杆菌分离株中39株检测到Ⅰ型整合酶基因,5株检测到Ⅱ型整合酶基因,分别占检测菌株的82.98％和10.64％,Ⅰ型整合酶阳性菌株多重耐药率(8重及以上)高于阴性菌株,所有检测到Ⅱ型整合酶基因的菌株也同时检测到了Ⅰ型整合酶基因,符合率100％,说明同一株细菌可同时携带多个整合子。
经PCR体外扩增、琼脂糖凝胶电泳分析,47株大肠杆菌分离株中,有15株检测到Ⅰ型整合子基因盒,阳性率为31.91％,基因盒大小共4种,通过凝胶电泳图谱回归方程计算,大小分别为544bp、1075bp、1618、2302bp。15株阳性菌中含544bp的有1株,含1075bp的有1株,含1618 bp的有9株,含2302bp的有4株。Ⅰ型整合子阳性菌易表现出对强力霉素、氨苄青霉素、链霉素、复方新诺明、羧苄青霉素的耐药性,耐药率分别为100％(15/15)、93.3％(14/15)、93.3％(14/15)、93.3％(14/15)、100％(15/15)。
本研究表明,浙江省仔猪黄白痢大肠杆菌的耐药性已经相当严重,且Ⅰ型整合子携带率高,耐药率突出,Ⅰ型整合子在介导耐药基因水平转移引起的细菌(多重)耐药性方面具有重要作用。多粘菌素B等抗菌药物防突变能力不尽相同,因此,为减少和控制耐药性的发生发展,在临床使用抗菌药物时不仅要考虑抗菌药物的MIC等参数,还要重视菌株的MPC及MSW,以防止耐药突变菌选择及优势生长。