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自1975年杂交瘤技术问世以来,单克隆抗体(mAb)因其高度的均一性、亲和力和选择性等优点,在临床诊断和治疗等方面得到广泛应用。但鼠源性mAb存在可引起人体产生人抗鼠抗体(HAMA)反应、分子大而穿透能力差等缺陷,极大地削弱了其临床疗效。随着分子生物学的发展,人们可以通过抗体的人源化和小型化,降低鼠源性mAb的免疫原性,改善其药代动力学特性,从而克服其临床应用上的障碍。我们制备的鼠抗人肺癌单克隆抗体3D3,在一系列体内外研究中,显示出其具有较理想的临床应用前景。为了推进其临床应用研究,本文对mAb 3D3进行了人源化和分子小型化改造。采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化。设计并通过重叠PCR技术构建出hu3D3VH单域抗体基因。为了提高hu3D3VH的功能性亲和力,通过重组PCR技术分别将SV5-Cys基因和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,得到同源二聚体dihu3D3VH和四聚体tehu3D3VH基因。分别构建pET-22b(+)/hu3D3VH、pET-22b(+)/dihu3D3VH和pET-22b(+)/tehu3D3VH表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达。它们的表达产物均主要以包涵体的形式存在,且表达量均占菌体总蛋白的30%以上。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,目的蛋白的纯度均在95%以上。间接ELISA结果证实,单域抗体hu3D3VH的抗原反应性和特异性与3D3VH基本相同。竞争ELISA结果证实,hu3D3VH保留了单域抗体3D3VH的抗原表位特异性。流式细胞仪的分析结果显示,与3D3VH相比,hu3D3VH的抗原结合能力下降了约29%;而与hu3D3VH相比,dihu3D3VH和tehu3D3VH与靶抗原的结合能力分别提高了约60%和160%。本文成功建立了人源化单域抗体hu3D3VH的高效原核表达系统,制备的hu3D3VH保留了亲本抗体的抗原反应性和特异性,并通过基因工程技术获得了功能性亲和力得到优化的hu3D3VH的同源二聚体和四聚体。这些研究工作为进一步的体内外生物活性研究及研制新型的肺癌靶向治疗药物奠定了重要基础。